过表达hom基因对谷氨酸棒杆菌发酵L–异亮氨酸的影响

徐庆阳，孙家凯，谢希贤，陈 宁

(工业发酵微生物教育部重点实验室，天津科技大学生物工程学院，天津 300457)

过表达hom基因对谷氨酸棒杆菌发酵L–异亮氨酸的影响

徐庆阳，孙家凯，谢希贤，陈 宁

(工业发酵微生物教育部重点实验室，天津科技大学生物工程学院，天津 300457)

谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)中hom基因编码的高丝氨酸脱水酶为L–异亮氨酸合成过程的关键酶，本研究通过在L–异亮氨酸生产菌C. glutamicum YILW中过表达高丝氨酸脱水酶，考察过表达高丝氨酸脱水酶对发酵L–异亮氨酸产量的影响．以L–异亮氨酸生产菌C. glutamicum YILW基因组为模板克隆hom基因，将hom基因与表达载体pXMJ19连接构建出重组质粒pXMJ19-hom，再转入C. glutamicum YILW构建C. glutamicum YILW(pXMJ19-hom)．通过5,L罐发酵研究重组质粒对工程菌的生长、耗糖、L–异亮氨酸产量及副产物积累等方面的影响．结果显示，重组酶的表达使菌株对L–苏氨酸的抗反馈抑制作用得到加强．最终L–异亮氨酸和L–蛋氨酸积累量分别为36.5,g/L和2.8,g/L，分别较出发菌株提高7%和33%，同时L–赖氨酸合成量仅为2.1,g/L，较出发菌株降低了63.8%．

L–异亮氨酸；高丝氨酸脱水酶；过表达；谷氨酸棒杆菌

Abstract：Homoserine dehydratase，a key enzyme of L-isoleucine synthesis process，is encoded by the hom gene in Corynebacterium glutamicum. The effect of overexpressed homoserine dehydratase in C. glutamicum YILW on the production of L-isoleucine was studied. The hom gene was PCR amplified using C. glutamicum YILW genom ic DNA as template and then inserted into a multicopy plasmid pXMJ19,to construct a recombined expression plasmid pXMJ19-hom. The recombined plasm id was then transformed into C. glutamicum YILW to construct recombined C. glutamicum YILW(pXMJ19-hom). The effects of pXMJ19-hom on cell grow th，glucose consumption rate，yield of L-isoleucine and accumulation of byproducts were investigated by using 5,L batch fermentation. Enzyme studies showed that the recombined homoserine dehydratase expressed in C. glutamicum YILW(pXMJ19-hom)strain was much less sensitive to threonine inhibition. Compared w ith the original strain，the yields of L-isoleucine and L-methionine by using C. glutamicum YILW(pXMJ19-hom)were 36.5,g/L and 2.8,g/L，which indicated on increase of 7% and 33% respectively，but the yield of L-lysine was only 2.1,g/L，decreased by 63.8%.

Key words：L-isoleucine；homoserine dehydratase；overexpression；C. glutamicum

L–异亮氨酸(L-isoleucine)属于分支链氨基酸，是人体必需的八种氨基酸之一，具有多种生理功能，广泛应用于医药、食品及其调味剂、动物饲料、化妆品的制造，尤其是在医学研究和治疗中有十分重要的作用[1]．目前，利用微生物生产L–异亮氨酸的方法主要为直接发酵法，L–异亮氨酸产生菌大多由谷氨酸棒杆菌、乳糖发酵短杆菌及大肠杆菌选育而来[2]．工业化生产中广泛应用的L–异亮氨酸高产菌多为经过传统诱变育种获得的谷氨酸棒杆菌，但其副生杂酸比较多，尤其是赖氨酸、丙氨酸等，加大了后期提取获得高纯度L–异亮氨酸的难度[3]．

高丝氨酸脱水酶(homoserine dehydrogenase，EC1.1.1.3)是谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)中L–异亮氨酸的合成途径中的关键酶之一，由hom基因编码，受苏氨酸的反馈抑制和蛋氨酸的反馈阻遏．在L–异亮氨酸生物合成过程中，天冬氨酸半醛是合成赖氨酸、苏氨酸和蛋氨酸的共同代谢中间体，在谷氨酸棒杆菌中L–蛋氨酸和L–异亮氨酸均不同程度地阻遏hom-thrB操纵子的转录，阻断天冬氨酸半醛进入L–异亮氨酸生物合成途径，从而在一定程度上促进了赖氨酸的生物合成[4]．通过过表达关键酶解除其反馈抑制可以提高目的产物的代谢流量，减少中间产物的积累及副产物形成[5]．

前期实验中，史建明等[6]通过在C. glutamicum YILW中过量表达解除反馈抑制的苏氨酸脱水酶使得L–异亮氨酸产量增加了10.3%，达到32,g/L，副产物L–蛋氨酸及L–赖氨酸积累均有一定程度下降；在前期实验基础上，本文通过在C. glutamicum YILW中过量表达解除反馈抑制的高丝氨酸脱水酶，考察其对L–异亮氨酸产量及副产物积累等方面的影响，为进一步构建L–异亮氨酸高产菌奠定了实验及理论基础．

1 材料与方法

1.1 菌株和质粒

谷氨酸棒杆菌C. glutamicum ATCC13032，L–异亮氨酸生产菌C. glutamicum YILW(α–氨基–β–羟基戊酸抗性)，大肠杆菌–谷氨酸棒杆菌穿梭质粒pXMJ19(氯霉素抗性)，均保存于天津科技大学代谢工程研究室．

1.2 试剂与仪器

Taq DNA聚合酶、限制性内切酶，TaKaRa公司；PCR引物，华大基因有限公司；1,kbp DNA marker，Fermentas公司；DNA片胶回收试剂盒、基因组DNA的提取试剂盒、质粒小样快速提取试剂盒，北京博大泰克生物公司；氯霉素，北京索莱宝公司；蛋白胨、酵母粉，Oxoid公司；考马斯亮蓝蛋白测定试剂盒，南京建成生物工程研究所；其余试剂均为国产分析纯．

JY92–IIN型细胞超声破碎仪，宁波新芝生物科技股份有限公司；PTC–1148型PCR仪，美国BIO– RAD公司．

1.3 培养基

LB培养基、种子培养基及发酵培养基，见参考文献[7]．

1.4 方法

1.4.1 pXMJ19-hom表达载体的构建

以C. glutamicum YILW染色体DNA为模板，使用P1(5′-CGGCTAGAGCTC GTTCAATTGCCATGT CAGT-3′，划线处为Sac I酶切位点)和P2(5′-GCGCCGATCTAGA GTAATAGGACAACAACGC TC-3′，划线处为Xba I酶切位点)为引物PCR扩增出高丝氨酸脱水酶编码基因hom．使用Sac I和Xba I对PCR产物及质粒pXM J19进行双酶切，连接产物化学转化法转入E. coli DH5α，在终浓度为25,µg/m L氯霉素的LB平板上37,℃培养．用引物P3(5′-GACA ATTAATCATCGGCTCG-3′)、P4(5′-CAGGCTGAAA ATCTTCTCTC-3′)鉴定长出的转化子，挑选阳性克隆，双酶切验证，测序．

将测序验证正确的重组质粒pXMJ19-hom和对照质粒pXMJ19分别电转法转化C. glutamicum YILW感受态细胞(C. glutamicum感受态细胞的制备与电转化方法见文献[8])，用含有氯霉素的LB平板进行筛选并用引物P3、P4鉴定阳性转化子，所得阳性转化子即为工程菌C. glutamicum YILW(pXM J19-hom)，保存菌株．

1.4.2 SDS-PAGE分析

分别挑取含有pXMJ19和pXMJ19-hom质粒的谷氨酸棒杆菌单菌落接种到含氯霉素抗性的LB液体培养基中，32,℃、200,r/m in培养12,h后，以1%接种量转接至新鲜LB摇瓶培养基中，继续培养至吸光度为0.6～0.8，加IPTG(终浓度0.1,mmol/L)诱导4,h后取适量菌液进行SDS-PAGE蛋白电泳分析[9]．采用5%浓缩胶及12%分离胶的不连续垂直平板电泳进行蛋白分离，以C. glutamicum ATCC13032作为对照，比较C. glutamicum YILW(pXM J19)空质粒对照与C. glutamicum YILW(pXMJ19-hom)重组质粒蛋白表达情况．

1.4.3 酶活性分析方法

通过测定受氢体为2，3，5–氯化三苯基四唑(TTC)的脱氢酶活性来反映高丝氨酸脱水酶活性，酶活性具体测定方法及酶活力单位定义见文献[10]．每1,m L粗酶液1,h产生1,μg三苯基甲膳(TF)的量作为一个酶活力单位1,U．

L–苏氨酸对重组酶活性反馈抑制的测定：在反应体系中加入不同浓度的L–苏氨酸，按标准酶活测定方法测定酶活．

1.4.4 其他分析方法

菌体生物量的测定方法见文献[11]．

氨基酸含量的测定[12–13]：L–异亮氨酸、L–赖氨酸、L–蛋氨酸及L–缬氨酸含量采用高效液相分析系统测定，色谱分离条件：Agilent C18(15,mm× 4.6,mm，3.5,μm)，2，4–二硝基氟苯柱前衍生测定，乙腈与NaAc溶液进行梯度洗脱，柱温33,℃，流动相流量1,m L/min，检测波长360,nm．

2 结果与分析

2.1 构建pXM J19-hom表达质粒

以L–异亮氨酸生产菌C. glutamicum YILW基因组DNA为模板克隆hom基因片段，将纯化后的PCR产物双酶切后连接到表达载体pXMJ19上，构建出重组质粒pXMJ19-hom(图1)．分别进行Xba I单酶切及Xba I和Sac I双酶切验证，结果如图2所示．

重组质粒pXMJ19-hom单酶切后得到一条大小约为8,000,bp的特异性条带；双酶切后在约6,600,bp和1,400,bp处观察到目的条带，分别为酶切后的pXM J19载体与hom基因．结合测序结果表明重组质粒构建成功．

图1 pXM J19-hom重组质粒的构建Fig. 1 Construction of p lasm id pXM J19-hom

图2 重组质粒pXM J19-hom的酶切验证Fig. 2 Restriction digest confirmation of recombined plasm id pXM J19-hom

2.2 重组质粒的诱导表达

以C. glutamicum ATCC13032为对照，比较重组菌C. glutamicum YILW(pXM J19-hom)及C. glu tamicum YILW(pXMJ19)的蛋白表达情况．超声破碎菌体后，收集上清液，进行SDS-PAGE蛋白电泳，结果如图3所示．

图3 粗酶液SDS-PAGE分析Fig. 3 SDS-PAGE analysis of crude cell extracts

高丝氨酸脱水酶的相对分子质量为4.63×104；可以看出3种菌株在相对分子质量约为4.63×104处均有特异性条带，但蛋白表达量有一定差异(蛋白上样量一致)，C. glutamicum YILW(pXM J19)与 C. glutamicum ATCC13032的蛋白表达量差别不大，这可能是由于ATCC标准菌株和宿主菌中高丝氨酸脱水酶的表达量本身就比较少；但重组菌C. glutamicum YILW(pXMJ19-hom)蛋白表达量明显较前两者增多，证明表达载体pXMJ19-hom构建成功，并且高丝氨酸脱水酶得到过量表达．

2.3 L-苏氨酸对重组酶的反馈抑制作用

将C. glutamicum YILW(pXMJ19-hom)和C. glutamicum ATCC13032分别培养至对数中期，收集细胞，超声波破碎后，离心取上清液检测高丝氨酸脱水酶活性．反应体系中加入不同浓度的L–苏氨酸后，再分别加入适量的重组酶及野生型酶，按标准酶活测定方法测定酶活，结果如图4所示．可以看出，在未添加L–苏氨酸时，野生型酶与重组酶的活性分别为0.21,U和0.45,U，与对照菌相比，带有质粒pXMJ19-hom的C. glutamicum YILW高丝氨酸脱水酶酶活性提高了2.1倍，此结果表明，高丝氨酸脱水酶基因能在C. glutamicum YILW中有效表达．此外，随着L–苏氨酸浓度的增加，酶活力均出现明显下降的现象，尤其是野生型酶，当L–苏氨酸浓度达到14,mmol/L时，其酶活力完全丧失，而此时重组酶仍具有一定的活性，大约为0.09,U；当L–苏氨酸浓度进一步增加时，重组酶活力丧失速率明显减缓，当L–苏氨酸浓度达到16,mmol/L时，重组酶仍维持0.07,U的活性．可以看出，与标准菌相比，重组菌C. glutamicum YILW(pXMJ19-hom)对L–苏氨酸的抗反馈抑制作用得到有效加强，这可能是由于C. glutamicum YILW具有α–氨基–β–羟基戊酸(AHV)抗性，AHV是苏氨酸的结构类似物，从而在一定程度上解除了苏氨酸对高丝氨酸脱氢酶的反馈抑制，因而过表达hom基因可强化重组菌对L–苏氨酸的抗反馈抑制作用．

图4 L–苏氨酸浓度对重组酶与野生型酶活力的影响Fig. 4 Effects of L-threonine concentration on the activities of recombined and native homoserine dehydratases

2.4 重组质粒对菌体生长和耗糖的影响

将C. glutamicum YILW、C. glutamicum YILW (pXM J19)和C. glutamicum YILW(pXM J19-hom)这3株菌进行5,L发酵罐分批补料发酵68,h，每隔4,h测定生物量及比耗糖速率等参数，结果如图5所示．

C. glutamicum YILW菌体的延滞期最短，10,h后即进入对数生长期，且具有相对较高的比生长速率，菌体生长34,h左右进入稳定期，至发酵结束时最大生物量可达32.5,g/L．而C. glutamicum YILW (pXM J19)菌体延滞期相对较长，且进入对数生长期后维持较低的比生长速率，菌体最大生物量为30.1,g/L，较前者低7.3%，说明空质粒pXMJ19对C. glutamicum YILW的生长有一定滞后作用，但是影响作用较小；而C. glutamicum YILW(pXMJ19-hom)菌体延滞期最长，并且进入对数生长期后最大比生长速率也较小，发酵结束时菌体的最大生物量仅为28.4,g/L，分别较前两者低12.6%和5.6%．这可能是由于重组质粒pXM J19-hom复制和表达增加了菌体的代谢负担，从而导致菌体的生物量降低．

图5 重组质粒对菌体生物量的影响Fig. 5 Effects of recombined p lasm id on biomass

就耗糖速率而言，如图6所示，在一定范围内菌体生物量与耗糖速率成正比．

图6 重组质粒对菌体耗糖速率的影响Fig. 6 Effects of recombined p lasm id on sugar consum ption rate

当菌体进入衰退期后，耗糖速率均明显下降．C. glutamicum YILW在整个发酵过程中具有较高的耗糖速率，其最大耗糖速率为7.8,g/(L·h)，且在发酵后期仍能维持较高的耗糖速率．而重组菌C. g lutam icum Y ILW(pXM J19-hom)和C. glutamicum Y ILW(pXM J19)耗糖速率明显较C. glutam icum Y ILW缓慢，且两者在整个发酵过程中耗糖趋势相似，但前者在发酵中后期耗糖速率明显加快，在40,h左右达到最大耗糖速率8.5,g/(L·h)，这可能是由于中后期外源基因的表达使菌体能耗增加，耗糖速率快速增加，而在发酵后期耗糖速率快速下降，说明在发酵后期菌体衰退较快；此外，C. g lutam icum Y ILW (pXMJ19)最大耗糖速率仅为7.5,g/(L·h)，且在发酵后期也有一定程度的衰退．这说明外源质粒的加入对菌体的生长和耗糖均有一定的不利影响，同时重组菌容易发生衰退现象．

2.5 重组酶对L-异亮氨酸发酵的影响

不同菌株发酵生产L–异亮氨酸过程中L–异亮氨酸及副产物积累差异情况如图7所示．

图7 不同菌株发酵生产氨基酸的产量Fig. 7 Yield of am ino acid fermentation by different strains

由图7可知，出发菌株C. glutamicum YILW可积累L–异亮氨酸34.1,g/L，L–赖氨酸5.8,g/L，L–蛋氨酸也有一定程度的积累．而C. glutamicum YILW (pXM J19)的3种氨基酸产量均有下降，其中L–异亮氨酸及L–赖氨酸产量分别为32.2,g/L和5.3,g/L，分别较出发菌株下降5.6%和8.6%，表明空质粒的转入对于菌体合成氨基酸有一定的影响，这可能是由于菌体代谢负担加重的原故．此外，重组菌C. glutamicum YILW(pXMJ19-hom)除L–赖氨酸积累有明显下降外，其余氨基酸积累量均有明显增加．其中L–异亮氨酸和L–蛋氨酸积累量分别为36.5,g/L和2.8,g/L，分别较出发菌株提高7%和33%，而L–赖氨酸积累量仅为2.1,g/L，较出发菌株降低了63.8%．此外，L–缬氨酸的积累量基本没有变化．可以看出，通过在C. glutamicum YILW过表达高丝氨酸脱水酶成功强化了苏氨酸生物合成途径的代谢流，在一定程度上相对弱化了L–赖氨酸的生物合成，降低了L–赖氨酸积累量，使L–异亮氨酸的积累得到相对提高．

3 讨 论

本研究使用的L–异亮氨酸生产菌C. glutamicum YILW为经过传统诱变育种获得的谷氨酸棒杆菌，其发酵过程中积累赖氨酸比较多，从而使葡萄糖对L-异亮氨酸的转化率降低，也不利于后期提取获得高纯度L–异亮氨酸．若进一步经过传统诱变方法选育赖氨酸缺陷型菌株会产生大量次级突变，造成菌体生长缓慢等弱点[14]，这是目前工业生产中难以解决的问题之一．随着分子生物学和基因工程技术的兴起，基因敲除、基因重组等技术的成熟，L–异亮氨酸高产工程菌的构建也越来越受到重视．

本研究发现，在L–异亮氨酸生产菌C. glutamicum YILW中过表达高丝氨酸脱水酶可以明显降低副产物赖氨酸的积累量，但L–异亮氨酸产量却没有得到有效提高，这可能是因为L–异亮氨酸生物合成途径较长，高丝氨酸脱水酶的过表达同时增加了分支代谢途径的流量(L–蛋氨酸积累量提高33%)．大量研究结果表明，代谢流的控制分布在多个酶上，在任何情况下解除单个酶的反馈抑制作用是有限的[15]．Sahm等[16]通过扩增对反馈调节不敏感的高丝氨酸激酶及苏氨酸脱水酶基因，获得谷氨酸棒杆菌的L-异亮氨酸高产菌株，产量可达30,g/L，而在本实验中优化过后的菌株产量为36.5,g/L．如果利用基因工程技术将L–异亮氨酸生物合成途径中的其他关键酶基因如高丝氨酸激酶、苏氨酸脱水酶及乙酰乳酸合成酶的基因等进行串联表达，或者通过强化关键酶的启动子以及敲除代谢支路等途径使得碳、氮源以及能量代谢流尽可能多地进入中心代谢途径，就可以进一步强化L–异亮氨酸合成代谢途径．

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责任编辑：郎婧

Effects of Overexpression of Homoserine Dehydratase on L-Isoleucine Production in Corynebacterium glutamicum

XU Qingyang，SUN Jiakai，XIE Xixian，CHEN Ning
(Key Laboratory of Industrial Fermentation M icrobiology，M inistry of Education，College of Biotechnology，Tianjin University of Science & Technology，Tianjin 300457，China)

Q812

A

1672-6510(2012)05-0001-06

2012-03-06；

2012-04-07

国家发改委高技术产业化专项项目

徐庆阳（1980—），男，安徽萧县人，助理研究员；通信作者：陈 宁，教授，ningch@tust.edu.cn.