TNF-α刺激人牙周膜细胞表达MMP-9的研究

赵戬，潘春玲，刘俊超，李倩，潘亚萍

（中国医科大学口腔医学院牙周科，辽宁省口腔医学研究所牙周病学研究室，沈阳 110002）

牙周致病菌侵袭牙龈上皮细胞能够诱导多种细胞因子如 TNF-α、IL-8 等的过度表达［1］，使组织细胞释放较多的基质金属蛋白酶（matrix metalloproteinases，MMPs），造成牙周组织中胶原纤维的降解［2］。当细菌侵入组织深处时，牙周膜细胞对牙周致病菌的反应将成为牙周组织继续破坏的关键。本研究目的在于通过检测不同浓度的TNF-α刺激人牙周膜细胞（humanperiodontal ligment cells，hPDLCs）表达MMP-9的水平，探讨细菌、细胞因子和MMPs之间可能存在的复杂调控网络在慢性牙周炎中的重要作用。

1 材料与方法

1.1 hPDLCs的培养

刮取正畸原因拔除的健康无龋前磨牙的牙周膜组织，原代培养hPDLCs，取第4代细胞鉴定细胞来源，结果显示抗波形丝蛋白染色阳性，抗角蛋白染色阴性，证实来源于外胚间充质的hPDLCs。取第5代细胞用于实验［3，4］。

1.2 TNF-α刺激hPDLCs

实验组 1分别以不同浓度（1、2、5 ng/mL）的人重组TNF-α（博士德生物工程有限公司，武汉）与hPDLCs均匀混合24 h；实验组2以2 ng/mL的TNF-α 分别处理 hPDLCs 6 h、12 h、24 h、48 h；未经刺激的hPDLCs作为对照组。收集细胞上清液，用于MMP-9浓度的检测。

1.3 ELISA检测MMP-9浓度

采用人MMP-9 ELISA试剂盒（博士德生物工程有限公司，武汉）检测TNF-α刺激后的hPDLCs培养上清液相应蛋白含量。

1.4 统计学分析

2 结果

2.1 不同浓度的TNF-α刺激hPDLCs表达MMP-9的水平

0、1、2、5 ng/mL TNF-α 刺激 hPDLCs 24 h 表达MMP-9的水平分别为（0.628±0.314）ng/mL、（1.995±0.789）ng/mL、（4.129±1.525）ng/mL、（7.982±2.879）ng/mL。与对照组相比，各刺激组细胞表达MMP-9水平均显著增高（P<0.01），且各刺激组组间差异具有统计学意义（P<0.01）（图 1）。

2.2 2 ng/mL的 TNF-α刺激 hPDLCs不同时间MMP-9的表达水平

以2 ng/mL浓度的TNF-α分别刺激hPDLCs 6 h、12 h、24 h 及 48 h，hPDLCs表达 MMP-9 的水平分别为（1.074±0.427）ng/mL、（1.635±0.763）ng/mL、（4.129±1.525）ng/mL、（6.747±2.257）ng/mL。对照组（刺激0 h）的hPDLCs没有检测到MMP-9表达，6 h～12 h时MMP-9出现表达增强，之后持续增强。与6 h组对比，24 h、48 h组细胞上清中的MMP-9表达明显增高，而且24 h与48 h组间差异具有统计学意义（P<0.01）。6 h组与12 h组间差异则无统计学意义（P ＞ 0.05）（图 2）。

3 讨论

在牙周致病菌突破牙龈上皮第一道防线后，细菌及细胞因子与hPDLCs反应所产生的局部环境决定着慢性牙周炎的转归。已有研究证实牙周致病菌侵袭牙周组织后产生的TNF-α能够刺激多种细胞如成纤维细胞、牙龈上皮细胞等产生MMPs，但能否刺激人牙周膜细胞产生MMPs尚不十分清楚，国内尚未见报道。

本实验发现，随着TNF-α浓度增高、作用时间延长，hPDLCs产生MMP-9的水平随之增高。表达显著增高见于以2 ng/mL TNF-α刺激24 h以后。以5 ng/mL TNF-α刺激hPDLCs产生MMP-9的浓度是以0 ng/mL TNF-α刺激产生MMP-9的12.71倍；以2 ng/mLTNF-α刺激hPDLCs 48 h后产生的MMP-9浓度是刺激6 h的6.28倍。说明TNF-α以时间和剂量依赖的方式刺激hPDLCs表达MMP-9。

MMPs在慢性牙周炎致病过程中的牙周结缔组织破坏和骨吸收中发挥重要作用。牙周致病菌能够激活牙龈上皮细胞、hPDLCs产生多种细胞因子和MMPs［4］，它们参与并促进了牙周炎的发病过程。牙周致病菌在细菌-细胞相互作用中产生的细胞因子，与MMPs之间同时存在着复杂的相互作用［5，6］。

牙周致病菌在与牙龈上皮细胞、hPDLCs相互作用时，牙周组织局部产生较多的TNF-α。TNF-α是机体炎症反应与免疫应答的重要调节因子，能够诱导多种组织细胞表达MMP-9［7］。有证据显示TNF-α对MMPs的诱导作用主要是通过MAPK信号系统介导的NF-κB通路激活的［8］。牙周致病菌通过与特异性宿主受体结合，黏附并侵入牙龈上皮细胞及hPDLCs，启动细胞内信号通路，激活细胞因子网络。目前已经证实MMP-9的基因启动子位置存在于NF-κB、AP-1、SP-1 等多种核转录因子结合位点，促炎细胞因子可以通过这些位点上调MMP-9的表达［9，10］。其中，TNF-α 可能通过提高部分转录因子的活性诱导MMP-9表达。

本研究在国内首次证实了TNF-α以时间和剂量依赖性的方式刺激hPDLCs表达MMP-9，提示在牙周炎症过程中，在促炎细胞因子TNF-α的刺激下，牙周组织的主要成分hPDLCs成为MMP-9的又一个重要来源。TNF-α诱导炎性细胞的浸润和活化，MMP-9则为细胞迁移创造了条件。由此提示，细菌、细胞因子和MMPs三者发挥协同作用，形成了牙周致病菌、细胞因子、MMPs、细胞间基质及炎症反应之间复杂的网络关系，这与牙周炎的发生发展密切相关，为牙周病病因的研究提供理论依据。

［1］孙江，刘琼，章锦才.慢性牙周炎患者牙龈组织中IL-8的检测［J］.南方医科大学学报，2008，28（7）：1304-1308.

［2］Kou Y，Inaba H，Kato T，et al.Inflammatory responses of gingival epithelial cells stimulated withPorphyromonas gingivalisvesicles are inhibited by hop-associated polyphenols［J］.J Periodontol，2008，79（1）：174-180.

［3］沈舒宁，周威，福山逹郎，等.尼古丁对人牙周膜细胞基质金属蛋白酶-1、3 表达的影响［J］.牙体牙髓牙周病学杂志，2011，21（3）：149-153.

［4］Guan SM，Shu L，Fu SM，et al.Prevotella intermediaupregulates MMP-1 and MMP-8 expression in human periodontal ligament cells［J］.FEMS Microbiol Lett，2009，299（2）：214-222.

［5］Yao PL，Lin YC，Richburg JH.TNF alpha-mediated disruption of spermatogenesis in response to Sertoli cell injury in rodents is partially regulated by MMP2［J］.Biol Reprod，2009，80（3）：581-589.

［6］Setacci C，de Donato G，Chisci E，et al.Deferred urgency carotid artery stenting in symptomatic patients：clinical lessons and biomarker patterns from a prospective registry ［J］.Eur J Vasc Endovasc Surg，2008，35（6）：644-651.

［7］Chuang MJ，Sun KH，Tang SJ，et al.Tumor-derived tumor necrosis factor-alpha promotes progression and epithelial-mesenchymal transition in renal cell carcinoma cells［J］.Cancer Sci，2008，99（5）：905-913.

［8］Tseng YH，Chang KW，Liu CJ，et al.Areca nut extract represses migration and differentiation while activating matrix metalloproteinase-9 of normal gingival epithelial cells［J］.J Periodontal Res，2008，43（5）：490-499.

［9］Bildt MM，Bloemen M，Kuijpers-Jagtman AM，et al.Collagenolytic fragments and active gelatinase complexes in periodontitis［J］.J Periodontol，2008，79（9）：1704-1711.

［10］Botero JE，Contreras A，Parra B.Effects of cytomegalovirus infection on the mRNA expression of collagens and matrix metalloproteinases in gingival fibroblasts ［J］.J Periodontal Res，2008，43（6）：649-657.