实验性变态反应性脑脊髓炎大鼠正中隆起室管膜细胞的变化及意义

刘 梅，曹翠丽，马常升，王丽梅，王荣耕

(1河北医科大学西山校区，石家庄 050200;2河北医科大学基础医学研究所神经生物学研究室;3河北科技大学理学院)

实验性变态反应性脑脊髓炎(EAE)的主要病理损害是脱髓鞘、血管周和脑室周围的炎细胞浸润及血脑屏障的破坏［1］，是人类自身免疫性疾病多发性硬化的经典动物模型，对临床神经免疫学的研究起重要作用［2］。室周器官(CVOs)是指位于第三、四脑室壁上缺少血脑屏障的8个微小器官，它们是血携免疫信息分子(如细胞因子等)优先入脑位点［3］，在体内参与神经内分泌和神经免疫的调节。正中隆起(ME)是重要的CVOs之一，位于下丘脑内侧基底部，前后介于视交叉与垂体柄之间，正上方为第三脑室，腔面为室管膜细胞。2008年2月～2009年2月，我们采用光镜观察EAE大鼠不同时期ME室管膜细胞的变化及定位，进一步利用透射电镜观察室管膜细胞超微结构的改变，旨在探讨其在EAE发病中可能的作用。

1 材料与方法

1.1 材料 选择健康雌性Wistar大鼠20只，体质量180～200 g，普通环境饲养，保证12 h光照，12 h黑暗;成年豚鼠10只，体质量(400±20)g，由河北省实验动物中心提供。20只大鼠随机分为实验组15只和对照组5只。

1.2 实验方法 参考文献［4］以豚鼠脊髓匀浆和完全福氏佐剂制备免疫抗原(同时加入百日咳杆菌以增加EAE的发病程度)［5］，实验组予四肢足垫内一次性接种制作，成功标准:免疫后14～16 d发病，症状体征评分4分，表现为体质量减轻，食欲减退，肢体麻痹，人为将鼠翻倒后不能复位，伴或不伴有小便失禁;5分为濒死状态。症状再持续5～7 d后体征自然缓解。本实验动物体征评分、病理结果等均符合急性EAE诊断标准，死亡率极低。对照组四肢足垫内注射生理盐水0.4 ml。实验组于注射后7 d(潜伏期)、14 d(发病极期，表现为肢体麻痹，人为将鼠翻倒后不能复位或濒死状态)、21 d(恢复期，发病后症状缓解者，能自如活动)分别随机选择5只处死，对照组于实验21 d处死。

1.3 室管膜细胞观察 ①光镜:动物麻醉，常规经心灌注固定，取出整脑，冠状方向去除视交叉前和漏斗柄后部分，取中间脑组织在4%多聚甲醛磷酸缓冲液(4 ℃)后固定24 h，然后 PBS(0.1 M，pH 7.2)冲洗3次，梯度酒精脱水，入二甲苯透明，浸蜡包块，用Leica石蜡切片机切片，取ME部位捞片，60℃烤箱过夜。然后依次脱蜡，梯度酒精脱水，HE染色，透明封片，室温干燥后，显微镜观片，Olympus万能显微镜照相。②透射电镜:同上法取下脑块，将脑腹面向上，于视交叉两侧各1 mm平行做两道矢状切口，向后至漏斗柄处做一冠状切口，在距离脑底面3 mm处做一平行切口，取下组织即含ME，光镜定位，观察时腹面朝下，取ME组织块1.0 mm×1.0 mm×2.0 mm，2.5%戊二醛前固定，然后投入1%四氧化锇作后固定，Epon812包埋，LKB-V型超薄切片机切片，覆盖于铜制载网，同一样品分别制作单孔和多孔各2张铜网，醋酸铀、拘椽酸铅染，日立T-7500N透射电镜观察照相。

1.4 统计学方法 采用摄像机将切片组织图像输入计算机，随机选取ME 5个不重叠视野，采用华东理工大学自动免疫组化分析系统Version2.0自动分析仪记录细胞。数据以表示。应用SPSS10.0软件包进行统计处理。采用单因素方差分析，有显著差异者用q检验进行两两比较。检验水准α=0.05。

2 结果

2.1 光镜观察 光镜下，对照组室管膜带室管膜细胞排列整齐，呈单层或双层，较稀疏，100×100 μm2细胞数为(12.8±1.2)个(图①)。实验组7 d室管膜带室管膜细胞数目增多，排列密集，约3～5层，不规则，100 ×100 μm2细胞数为(28.2 ±1.6)个(图②);14 d室管膜带室管膜细胞数目明显增多，约5～7层以上，100 ×100 μm2细胞数为(37.3 ±3.1)个(图③)，21 d室管膜带室管膜细胞数目与对照组相近，呈单层或双层排列，100×100 μm2细胞数为(13.6 ±1.3)个。实验组 14 d 每 100 ×100 μm2细胞个数明显高于7 d，P 均 ＜0.01。

图1 光镜下室管膜带室管细胞

2.2 透射电镜观察 对照组室管膜细胞脑室面可见微绒毛和微突起，核染色质疏松，细胞之间可见紧密连接(图④)。实验组7 d室管膜细胞脑室面可见微绒毛和微突起，室管膜细胞出现不同的分泌现象:有的分泌颗粒呈蘑菇形，均质状，最大径4.0 μm，无膜包裹(图⑤);有的分泌颗粒结构疏松，颗粒内有大小不一的有膜囊泡，小的直径60 nm，大的直径180 nm，囊泡呈空泡状，约有40～50个有膜囊泡，并可见分泌物质释放弥散(图⑥)。14 d室管膜细胞脑室面微绒毛变短、稀疏。室管膜细胞内线粒体形态肿胀，呈圆形、卵圆形，集中于细胞游离面。细胞内可见溶酶体吞噬现象。并观察到室管膜细胞向外凸起，形成长椭圆形分泌颗粒，分泌颗粒有胞膜，最大径约2.5 μm，其内有点状颗粒，未见空泡，质地均匀，分泌颗粒有的部位胞膜破溃(图⑦)。21 d室管膜细胞脑室面微绒毛仍较少，细胞核清晰，形态较规整，与对照组接近。

图2 电镜下ME室管膜细胞

3 讨论

ME是脑脊液经第三脑室流入第四脑室的必由之路，从其部位、血管和神经联系分布来看，对脑脊液成分，尤其是免疫信息分子具有重要的监控作用，是下丘脑—垂体—内分泌轴上传下达的关键点［3］，当机体免疫状态改变时会发生形态学变化，被认为在脑脊液与垂体门脉之间进行物质转运，对垂体行使某种调控作用［6］。

吕佩源等［7］发现，血管性痴呆小鼠ME的室管膜细胞表面凹凸不平，分泌颗粒明显减少，有皱缩现象，存在着超微结构的损伤;宋春风等［8］认为，大鼠肌肉注射醋酸可的松后，下丘脑ME室管膜细胞出现孔洞样变化，微绒毛结构和分布异常;一氧化氮是神经系统中的信使分子，朱进霞等［9］证实ME外侧带有一氧化氮合酶阳性神经元，说明其在激素释放和递质的转运中起重要作用。

本研究发现，ME室管膜带细胞在EAE的不同时期有所改变，光镜下潜伏期出现细胞数目增多，发病极期达到高峰，恢复期基本接近正常，其变化特点与EAE发病程度相一致;透射电镜下潜伏期时EAE还未发病，而ME室管膜细胞即出现分泌颗粒，提示有分泌物质进入脑脊液;发病极期分泌功能旺盛，恢复期基本正常，与EAE疾病进程相一致，此形态变化显示ME在EAE时发生病理改变早于临床症状出现，且与病情进展程度呈正相关，提示该处细胞对免疫物质刺激敏感，室管膜细胞的分泌物参与了疾病进程。由此我们推断，在EAE发病过程中，血液中激活的T淋巴细胞及其分泌物质优先通过血—脑脊液途径进入脑脊液，经免疫—神经—内分泌网络处理后引起ME分泌;ME分泌物质进入脑脊液，通过脑脊液—脑通路入脑，激发引起脑室周的炎性反应，此与文献报道相一致［6］;此外ME所感受的信息又可以传入垂体前叶，激发下丘脑—垂体—肾上腺轴，分泌肾上腺皮质激素，使机体免疫功能受抑制，反馈减少ME室管膜细胞的分泌，使恢复期细胞的形态结构基本恢复正常，说明ME室管膜细胞参与了脑内的免疫物质传递，从而对机体的自身免疫性反应进行调节，在免疫—神经—内分泌网络中起重要作用。

总之，ME在EAE时发生病理改变早于临床症状发生，且与病情进展程度呈正相关，提示其可能参与了脑的免疫调节。

［1］Linker RA，Sendtner M，Gold R.Mechanisms of axonal degeneration in EAE-lessons from CNTF and MHC I knockout mice［J］.Neurol Sci，2005，233(1-2):167-172.

［2］Behi ME，Dubucquoi S，Lefranc D，et al.New insights into cellresponses involved in experimental autoimmune encephalomyelitis andmultiple sclerosis［J］.Immunol Lett，2005，1(1):11-26.

［3］Gaillard RC.Interaction between the hypothalamo-pituitary-adrenal axis and the immunological system［J］.Ann Endocrinol，2001，62(2):155.

［4］董梅，刘瑞春，郭力，等.Wistar大鼠多病程实验性变态反应性脑脊髓炎的模型建立［J］.中国免疫学杂志，2006，22(1):78-81.

［5］林嘉友.实验性变态反应性脑脊髓炎动物模型［J］.中国神经免疫学和神经病学杂志，2003，10(1):33-34.

［6］杨天祝，贾漪涛，马常升，等.大鼠室周器官的形态学观察［J］.河北医科大学学报，2002，23(3):129-132.

［7］吕佩源，尹昱，王丽，等.血管性痴呆小鼠第三脑室室管膜扫描电镜特征观察［J］.中国医学物理学杂志，2004，21(5):144-146.

［8］宋春风，尹桂山，李向印，等.糖皮质激素对正中隆起室管膜细胞的影响［J］.电子显微学报，2000，19(3):253-254.

［9］朱进霞，周明付，张华，等.一氧化氮合酶阳性神经元在大鼠下丘脑的分布［J］.河南医科大学学报，1996，31(2):42-44.