赖诺普利对大鼠胆汁淤积性肝硬化的抗肝纤维化作用

吴红专，朱灿阳，刘俊

(海南省人民医院药学部，海南海口570311）

·实验研究·

赖诺普利对大鼠胆汁淤积性肝硬化的抗肝纤维化作用

吴红专，朱灿阳，刘俊

(海南省人民医院药学部，海南海口570311）

目的探讨赖诺普利对胆汁淤积性肝硬化的抗肝纤维化作用。方法采用胆总管结扎术制备大鼠胆汁淤积性肝硬化模型，分为赖诺普利组和模型对照组。前者于术后第3周给药，具体为：赖诺普利0.1 mg/kg灌胃，1次/d，连续4周；后者于术后第3周给予生理盐水10 ml/kg灌胃，1次/d，连续4周。同期设假手术组作为空白对照。6周后处死大鼠，取三组实验大鼠肝组织进行常规病理染色和胶原纤维染色；用放射免疫法测定各组血清透明质酸酶(HA)和层粘连蛋白(LN)含量，并测定肝组织羟脯氨酸(HYP）含量。结果与空白对照组比较，赖诺普利组和模型对照组的血清HA、LN活性均下降，而肝组织HYP含量均升高，差异均有统计学意义(P＜0.05)。与模型对照组比较，赖诺普利组肝细胞损伤和肝纤维化程度较轻。赖诺普利组的血清HA、LN活性以及肝组织HYP含量分别为(62.1±2.23)ng/ml、(42.8±6.23)ng/ml和(1.6±0.15)μg/mg，明显低于模型对照组的(97.5±4.50)ng/ml、(66.5±7.32）ng/ml和(2.0±0.27）μg/mg(P＜0.05）。结论赖诺普利可以有效改善胆汁淤积性肝硬化大鼠模型的肝纤维化程度。

肝硬化；胆汁淤积；肝纤维化；赖诺普利

肝纤维化是慢性肝病重要的病理特征，也是慢性肝炎发展至肝硬化的必经阶段，但迄今为止，尚缺乏能够有效治疗肝纤维化的药物。目前认为，肝纤维化的发生机制主要是肝星状细胞的活化以及细胞外基质的合成与降解失衡导致其在细胞间质过度沉积所致。有研究表明，血管紧张素转换酶抑制剂(ACEI)与紧张素Ⅱ(AT-Ⅱ)受体阻断剂均可以抑制肝纤维化[1-2]，但相关的研究报道较少。本研究于2011年5～10月建立胆汁淤积性肝硬化动物实验模型，旨在探讨ACEI药物赖诺普利在胆汁淤积性肝硬化大鼠模型中的抗肝纤维化作用。

1 材料与方法

1.1 动物14周龄Wistar大鼠30只，雌雄不分，体重(202±18)g，由海南省药品检验所实验动物中心提供。

1.2 药品与试剂赖诺普利10 mg/片，为捷利康有限公司产品；层粘蛋白(LN)放射兔疫分析测定盒、透明质酸(HA)放射免疫分析测定盒均为北京科美东雅生物技术有限公司产品；羟脯氨酸(HYP)为南京建成生物工程研究所产品。

1.3 实验分组参照文献[3]将30只SD大鼠随机分为三组：空白对照组、模型对照组和赖诺普利组，各10只。模型对照组及赖诺普利组均实施胆总管结扎术，具体为：固定SD大鼠，用戊巴比妥钠(45 mg/kg)麻醉，正中切口进腹，暴露胆总管，用丝线结扎横断胆总管，关腹。空白对照组开腹后仅游离胆总管不予结扎，关腹。三组SD大鼠术后1～3 d肌注青霉素，2次/d，2.5 WU/次。术后第3周模型对照组和赖诺普利组分别开始给药，模型对照组：生理盐水10 ml/kg灌胃，1次/d，连续4周；赖诺普利组：赖诺普利0.1 mg/kg灌胃，1次/d，连续4周。

1.4 检测指标及评价末次给药24 h取SD大鼠血清4 ml检测HA和LN含量。处死SD大鼠后在右肝最厚处切取1.0 cm×0.8 cm左右的肝组织2块，1块按照常规病理制作石蜡切片，切片厚4 μm，采用常规病理染色(HE)及胶原纤维染色(Masson)观察；另1块制成肝组织匀浆检测HYP含量。光镜下观察大鼠肝组织的肝纤维化程度及肝组织炎症活动度参照文献[4]制定的肝纤维化程度分级标准：(－)为汇管区纤维组织无增生，(+)为增生后面积＜肝小叶1/3，(++)为增生后面积占肝小叶1/3～2/3，(+++)为增生后面积＞肝小叶2/3。

1.5 统计学分析应用SPSS17.0软件对数据进行处理，计量资料以均数±标准差表示，用单因素方差或秩和检验，肝纤维化程度分级数据用秩和检验。以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 三组SD大鼠的大体情况空白对照组大鼠发育良好，毛发有光泽，无尾黄、耳黄、毛发黄、小便发黄等；模型对照组精神差，活动少，出现尾部黄染、耳黄、毛发黄染等表现；赖诺普利组健康状态相对较好，毛色较好，尾部黄染、耳黄、毛发黄染等不明显。

2.2 三组SD大鼠的肝组织病理学检查大体观察：与空白对照组比较，模型对照组的肝脏表面呈黄绿色，表面呈桔皮样，部分表面呈颗粒状，边缘变钝，质脆；赖诺普利组的肝脏颜色较红润，呈花斑状，柔软，表面颗粒较少，未见明显结节。光镜观察：空白对照组的肝脏小叶结构清晰，肝细胞索由中央静脉呈放射状向四周排列，肝窦正常，肝窦内及汇管区周围有少量间质细胞；模型对照组的肝组织结构破坏严重，肝细胞呈花环状，多数有管腔，可见大量胶原组织沉积，纤维化增生明显；赖诺普利组的胆管上皮细胞增生汇管区面积扩大，增生的胆管上皮细胞周围有纤维组织增生，可见肝细胞部分坏死及炎性细胞浸润。按照肝纤维化程度分级标准，赖诺普利组中4只大鼠肝纤维化(+)，6只肝纤维化(++)，无肝纤维化(+++)，肝纤维化程度明显低于模型对照组，见表1。

表1 三组大鼠肝脏的纤维化程度分级情况（只）

2.3 三组SD大鼠肝组织HYP的比较空白对照组、模型对照组和赖诺普利组的大鼠肝脏HYP分别为(0.8±0.12)μg/mg、(2.0±0.27)μg/mg和(1.6± 0.15)μg/mg；与空白对照组比较，模型对照组和赖诺普利组HYP含量均显著升高(P＜0.05)；与模型对照组比较，赖诺普利组的HYP含量明显降低(P＜0.05)。

2.4 三组SD大鼠血清HA、LN的比较与空白对照组比较，模型对照组和赖诺普利组大鼠血清HA、LN含量均显著升高(P＜0.05)；与模型对照组比较，赖诺普利组的HA、LN含量明显降低(P＜0.05)，见表2。

表1 三组SD大鼠血清HA、LN的比较（ng/ml）

3 讨论

肝纤维化是慢性肝损伤向肝硬化发展的重要环节和必经阶段，贯穿于肝硬化发展的整个过程，然而目前针对肝纤维化本身治疗的有效药物较少，因此积极寻找抗肝纤维化药物迫在眉睫。从生物化学角度来看，肝纤维化与肝脏细胞外基质的合成增加密切相关，因此目前常常通过检测血清中细胞外基质成分及其代谢产物来判断肝纤维化，包括HA、LN、Ⅲ型前胶原氨基端肽(PCⅢNP)和Ⅳ型胶原(C-Ⅳ)[5-7]。HYP是胶原蛋白中特有的代谢产物，其在肝脏组织中的含量可以用来衡量肝纤维化的程度[8-9]。赖诺普利是继卡托普利、依那普利之后第3代含羧基活性型ACEI，能有效抑制AT-Ⅱ生成，可以作为抗肝纤维化的药物[2]。Wolf等[10]报道ACEI与AT-Ⅱ受体阻断剂抑制肝纤维化的机制包括两个方面：一方面抑制AT-Ⅱ对肝星状细胞活化后直接促增殖及促细胞外基质分泌效应，另一方面可以消除AT-Ⅱ对间质纤维母细胞TGF-β自分泌的正向调节作用，从而抑制细胞外基质的合成。

为探讨赖诺普利在肝纤维化中的作用，本实验构建了胆汁淤积性肝纤维化模型。既往文献报道[11-12]，采取胆总管结扎大鼠模型在2～6周能够有效建立胆汁淤积性肝纤维化模型，因此本组实验采用两周后给药，直至6周结束时通过病理和血清放射免疫法检测分析赖诺普利对胆管结扎诱发大鼠淤胆性肝纤维化的干预效果。结果显示，与模型对照组比较，赖诺普利组大鼠的健康状态相对较好，全身黄染不明显，肝组织中胆管上皮细胞有增生，周围伴有纤维组织增生，肝细胞呈部分坏死及炎性细胞浸润；血清放射免疫法检测HA、LN的活性均有明显的下降，肝组织HYP含量亦明显减少。上述结果提示赖诺普利可降解淤胆性肝纤维化大鼠细胞外基质的合成，胶原沉积减少，明显降低肝纤维化的程度。

综上所述，赖诺普利能够延缓肝纤维化的进展以及减轻肝组织的损伤，对大鼠淤胆性肝硬化的肝纤维化有良好的治疗作用，其具体的分子生物学机制尚需进一步探讨。

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Inhibitory effects of lisinopril on obstructive cholestasis induced liver fibrosis in mice.

WU Hong-zhuan,ZHU Chan-yang,LIU Jun.Department of Pharmacy,Peolple's Hospital of Hainan Province,Haikou 570311，Hainan，CHINA

ObjectiveTo study the effect of lisinopril on bile duct ligation-induced biliary cholestasis on liver of mice.MethodsThe experimental model mice of hepatic fibrosis was induced by common bile duct ligation,which were divided into model control group and lisinopril group.Three weeks after the operation,lisinopril(0.1 mg/kg)and physiological saline(10 ml/kg)were administrated respectively by intragastric in lisinopril group and model control group,with once a day for 4 consecutive weeks.False operation group was as blank control in the same period.All the mice were sacrificed six weeks later.Liver tissues of the three groups were detected by routine histological staining and collagen fiber staining;serum hyaluronate lyase(HA)and laminin(LN)levels were measured by radioimmunoassay,including liver hydroxyproline(HYP)content.ResultsSerum HA and LN contents in model control group and lisinopril group were decresed and liver HYP content were increased compared with those in blank control group (P＜0.05).Liver cells injury and the degree of liver fibrosis in lisinopril group were lighter compared with those in model group.Serum HA,LN contents and liver HYP content in lisinopril group were(62.1±2.23)ng/ml,(42.8±6.23)ng/ml and(1.6±0.150)μg/mg,significantly lower than those in model group[（97.5±4.50）ng/ml,(66.5±7.32)ng/ml and(2.0± 0.27)μg/mg;all theP＜0.05].ConclusionLisinopril has effect on preventing hepatic fibrosis in mice model with bile duct ligation-induced biliary cholestasis.

Cirrhosis;Cholestasis;Liver fibrosis;Lisinopril

R-332

A

1003—6350(2012）18—015—03

10.3969/j.issn.1003-6350.2012.18.006

2012-04-01)

吴红专（1973—），女，海南省海口市人，主管药师，本科。E-mail：whz04111@126.com