常温下CANON反应器中功能微生物的沿程分布

刘 涛，李 冬，曾辉平，张 杰，

(1.哈尔滨工业大学城市水资源与水环境国家重点实验室，150090哈尔滨;2.北京工业大学水质科学与水环境恢复工程北京市重点实验室，100124北京)

由于上向流曝气生物滤池具有处理效率高、占地面积小、抗冲击负荷能力强等特点［1－2］，目前许多CANON工艺多采用此形式实现.然而，这种反应器作为一种推流式反应器，由于滤池内部自下而上各段NH4+－N负荷及其他水力条件不同，会造成滤层各段微生物的活性及群落结构不同，从而会出现反应器沿程各段对NH4+－N的去除能力不同［3］.因此，需要分析内部微生物的沿程分布规律，从而优化工艺运行条件.然而，目前这种类型CANON反应器内部的微生物沿程分布研究还鲜见报道［4－5］.由于CANON反应器中的两种功能细菌为氨氧化细菌(AOB)与厌氧氨氧化菌(ANAMMOX菌)［6］，相比于分离、纯化等传统的生物学方法，应用显微技术及分子生物技术研究两类功能微生物的形态特征、群落结构及种属特性，能够更有效、更准确地获得微生物方面的信息.扫描电镜(SEM)虽然不能对微生物种群进行直接定性，但可对系统内微生物形态特征的变化进行直观的评价.此外，在CANON工艺中，NH4+－N在氨单加氧酶(AMO)的催化作用下氧化生成羟胺(NH2OH)，这是脱氮反应的第一步，也是极为关键的一步［7］，amoA基因正是编码氨单加氧酶(AMO)活性位点多肽的基因［8－9］.利用amoA基因作为分子标记可以从分子水平研究氨氧化细菌的多样性及种属特性［10］.对于厌氧氨氧化微生物来说，应用其特异性引物扩增16SrDNA作为标记可以研究其种群结构［11］.

本文研究上向流曝气生物滤池型CANON反应器中功能微生物种群结构及种属特性的沿程变化规律，以便更合理地设置功能分区、优化设计参数，提高脱氮效果.

1 实验

1.1 CANON反应器及样品采集

上向流曝气生物滤池型CANON反应器如图1所示.反应器内径150mm，有效高度700mm，总容积8.15L，有效体积1.8L，柱内装填火山岩活性生物陶粒滤料.以NaHCO3、(NH4)2SO4、KH2PO4与自来水配制进水氨氮为300mg/L左右原水，从反应器底部进入，由上部出水口排出，在整个过程中，温度一直保持在16～20℃.

图1 CANON反应器试验装置及工艺流程图

在反应器连续稳定运行第28天，分别从反应器滤层由上至下100、300、500和700 mm处采集滤料若干，将样品保存于－20℃冰箱中用以提取基因组DNA.

1.2 扫描电镜观察

取不同滤层高度采集的滤料少许，经戊二醛固定、乙醇梯度脱水、乙酸异戊酯置换、临界点干燥、离子溅射喷金处理后使用日立S－4300型扫描电镜仪对样品进行观察并拍照.每个样品随机拍摄5～10张照片.

1.3 基因组DNA的提取

用无菌玻璃棒搅拌滤料以使生物膜脱落，称取1g湿质量的生物膜，加入2.7mLDNA提取液(100mmol/LTris-HCl，100mmol/LEDTA(乙二胺四乙酸)，1.5mol/LNaCl，100mmol/LNa3PO3，1%CTAB(十六烷基三甲基溴化铵)，pH8.0)，并加入50μL蛋白酶K(30g/L)，50μL溶菌酶(20g/L)以及数粒玻璃珠，37℃水浴30min.此后加入1.5mLSDS(十二烷基硫酸钠)溶液(200g/L)，65℃水溶2h，期间每隔20min上下颠倒混匀一次.8000g离心10min，将上清液转移至新的无菌离心管中，并加入等体积的氯仿/异戊醇(24∶1)，混匀，8000g离心10min后将上清液转移至新的无菌离心管中，并加入0.6倍体积预冷的异丙醇，－20℃过夜保存.12000g离心5min，弃上清，再以同样的转速离心3min，弃上清液并将样品置于通风处彻底晾干，之后用50μL1×TEbuffer(10mmol/LTris-HCl;1mmol/LEDTA，pH8.0)溶解.所提取的基因组DNA结果用0.8%(质量分数)的琼脂糖凝胶电泳检测以备PCR用.

1.4 PCR扩增及DGGE电泳

用引物amoA-1F和amoA-2R［12］扩增氨氧化细菌amoA基因.其中amoA-1F的5＇端所加GC夹子为DGGE设计;对于ANAMMOX菌的特异性片段的扩增采用巢式PCR方法:第一阶段先用细菌的通用引物27F/1492R［13］进行16SrDNA序列的PCR扩增，并对PCR产物进行纯化回收，之后以第一阶段的PCR产物为模板，以ANAMMOX菌的特异性引物对Amx368F/Amx820［14］进行第二阶段的PCR扩增，Amx368F的5＇端加GC夹子同样为后续DGGE所设计.PCR反应体系为25μL，其中包含2.5μL10×ExTaqbuffer(Mg2+Plus)，dNTP2.0μL，引物各1.0μL，TaKaRaExTaq酶0.625U，模板DNA约1.0ng，用无菌水补齐至25μL.各种引物序列及PCR反应条件见文献［12-14］.PCR扩增产物用1.5%(质量分数)的琼脂糖凝胶进行电泳检测.

采用北京天根公司DNA胶回收试剂盒进行PCR产物的纯化回收，具体操作按说明书进行.对PCR产物进行DGGE分析:聚丙烯酰胺质量分数8%，变性梯度为30%～60%，电压120V，电泳时间5h，PCR产物上样量约500ng，电泳在Dcode UniversalMutation Detection System仪器上进行.电泳结束后用Bassam等［15］的方法对凝胶进行银染，并对凝胶拍照.

1.5 基因文库的构建、测序及系统发育分析

切取DGGE图谱中的目的条带溶于50μLTE(pH8.0)溶液中，4℃过夜，以此为模板，以不含GC夹的引物进行PCR扩增，并对PCR产物进行纯化.按照pMD19-Tplasmidvectorsystem说明书进行基因片段与载体的连接后，转化到大肠杆菌DH5α感受态细胞中，通过蓝白斑法筛选阳性克隆子并进行测序.采用BLAST对测序结果和基因库中已知序列进行相似性分析，并利用MEGA4.0软件，采用邻位相连法(Neighbor-Joining)构建系统发育树，自举值为1000.

2 结果与讨论

2.1 稳定运行时的脱氮效果

反应器在常温、进水氨氮为300 mg/L条件下，通过调节曝气及水力停留时间实现了CANON的稳定运行，并连续稳定运行约30 d.取样时反应器运行工况为:进水氨氮质量浓度300 mg/L，温度18℃，曝气量4.5 L/min，氨氮去除率达83%，氨氮去除负荷为1.4kg/(m3·d)，总氮去除率75%，总氮去除负荷1.1kg/(m3·d)，出水硝氮浓度维持在20～35mg/L.尽管得到的总氮去除负荷略低于Sliekers以及Chuang等的研究［16-17］，但依然属于较高的去除负荷，因此，分析在该运行工况下的微生物沿程分布特点更具有代表性.

2.2 电镜(SEM)照片

由于氨氧化细菌和厌氧氨氧化细菌形态多样，一般难以通过形态来区分和鉴定其种属.污水处理厂经常出现的氨氧化细菌主要是亚硝化球菌属(Nitrosococcus)和亚硝化单胞菌属(Nitrosomonas)，其形态分别呈球状和短杆状，而亚硝酸盐氧化菌主要是硝化螺菌属(Nitrospira)和硝化杆菌属(Nitrobacter)，形态分别呈螺旋状和杆状［18］.过去曾报导厌氧氨氧化菌为规则或者不规则的球形和椭球形，单生或成簇聚生［19］，直径约0.8～1.1 μm.因此，图2中的球菌和椭球菌可能为亚硝化球菌属(Nitrosococcus)和厌氧氨氧化细菌，短杆菌可能为亚硝化单胞菌属(Nitrosomonas)，而长杆菌可能为硝化杆菌属(Nitrobacter).

由图2可见，显微镜下可检测到长杆菌、短杆菌、球菌和椭球形的菌，其中直径0.2～1.0μm的椭球形和球形菌为优势菌，几乎未检测到螺旋状细菌，而长杆菌所占的比例也很低，说明反应器中亚硝酸盐氧化菌含量很低，这也保证了反应器中的亚氮几乎不会被硝酸盐氧化菌利用，从而得到有效积累，为后续的厌氧氨氧化创造条件.图2(a)中微生物数量较少，多数为单生，并未成簇聚生;在滤层300mm处，细菌数量增加，且出现了聚集生长的趋势(图2(b));随着滤层深度的增加，微生物数量明显增多(图2(c)、(d))，且成簇聚生，其中以椭球形和球形菌为主，但也存在数量可观的短杆菌.这些细菌可能为氨氧化细菌和厌氧氨氧化菌，其种属特性将通过接下来的分子生物学技术进一步验证.

图2 不同滤层高度样品的电镜照片

2.3 PCR-DGGE图谱及系统发育分析

由于PCR-DGGE图谱中的每一条带代表一个可能的细菌类群或可操作分类单位(OTU)，条带的数量和信号强度与生物多样性和生物数量密切相关，基于PCR-DGGE图谱可以确定不同取样处微生物的种类和数量关系.

不同高度采集样品的DGGE分析见图3.氨氧化细菌在100和300mm处的可见条带只有3条，而在500和700mm处条带数量明显增多，条带信号明显增强，说明氨氧化细菌在滤层500mm处以下的种类和数量明显增多，这与扫描电镜试验的结果一致.其原因可能为:由于反应器采用上向流曝气，而氨氧化细菌是一种严格的好氧细菌，在反应器底部曝气量充足，有利于其生长.而富含氨氮基质的进水也是从反应器底部进入，氨氮会率先供给下部的氨氧化细菌.随着反应器内溶解氧和氨氮被利用，在反应器上部的氨氧化细菌受到抑制，从而造成种类和数量的下降.此外，水力冲刷作用导致上部生物膜在一定程度上的破坏也是造成这种现象的原因之一.Purkhold等研究表明:污水处理系统中氨氧化细菌的多样性程度越高，对复杂环境的适应能力就越强，其抗冲击能力也就越强;反之，如果系统中只含有单一的氨氧化细菌，其抗干扰能力就较差［10］.在本实验所用的CANON反应器中，500 mm以下处的氨氧化细菌的多样性程度很高，具有较强的抗冲击负荷.然而在300mm以上的位置，氨氧化细菌多样性很低，抗干扰能力较差.因此，为了提高滤层上部区域的抗冲击负荷，需要采取一定措施提高氨氧化细菌的多样性程度，其中最直接的做法就是对滤料进行重新排布.考虑到火山岩生物陶粒滤料填充的CANON反应器内已经形成稳定的气道，重新排布滤料可能会破坏系统内的好氧/厌氧区域分布，进而破坏功能微生物的稳定性，影响系统的脱氮性能，可改用便于排布的软性填料，比如海绵、无纺布等.但是它们对细菌的持留能力可能低于火山岩生物陶粒滤料，从而使CANON的启动时间延长，具体解决方案还需进一步研究.

对于ANAMMOX菌来说，4个取样点的DGGE图谱基本一致，而且只有两条可见条带，说明ANAMMOX菌的群落结构在整个反应器中基本一致，几乎不随滤层高度的变化而变化.此外，条带6的信号沿滤层自上而下有逐渐增强的趋势，也说明ANAMMOX菌在反应器下方的数量要略多于上方.原因可能在于反应器上部氨氧化细菌种类和数量的减少，不能为ANAMMOX菌很好地创造厌氧环境，也不能提供ANAMMOX菌代谢所需足够的亚硝酸盐.此外，水力冲刷作用导致上部生物膜一定程度的破坏也是造成这种现象的原因之一.值得注意的是，通过条带信号的强弱只能粗略推测细菌数量的多少，要想更精确地检测细菌数量，还需要通过荧光定量PCR等其他检测手段.

图3 PCR产物DGGE图谱沿程分布

对DGGE图谱上的7条主要条带进行切割、DNA洗脱、回收、重新扩增，构建基因克隆文库，经测序所得的DNA序列提交至GenBank，得到的GenBank序列号为JN367453-JN367457以及JQ753318.对测序结果和基因库中已知序列进行相似性对比分析，结果见表1.由于条带6和7之间相似度达98%，可以归并为一个可操作分类单位(OTU)，它们与Candidatus Kuenenia stuttgariensis相似度达98%.这些已知细菌的形态多为球形、椭球形和短杆状，与前文扫描电镜结果一致.

表1 7个条带所代表的基因序列对比结果

基于amoA基因序列构建系统发育树(图4)，树图的外源基因为4种常见的氨氧化微生物，即亚硝化单胞菌属(Nitrosomonas)、亚硝化螺菌属(Nitrosospira)、亚硝化球菌属(Nitrosococcus)、亚硝化叶菌属(Nitrosolobus)以及一些未培养的氨氧化细菌.从图4可知，条带3与亚硝化球菌属(Nitrosococcus)处于一个分枝上，其余4个条带均与亚硝化单胞菌属(Nitrosomonas)的亲缘关系较近，与亚硝化叶菌(Nitrosolobus)、亚硝化螺菌(Nitrosospira)的遗传距离较远.由于所研究的反应器进水氨氮浓度为300 mg/L，属于较高的氨氮环境，在该条件中检测到亚硝化球菌(Nitrosococcus)的存在，这与前人报道的亚硝化球菌属(Nitrosococcus)在高氨氮环境中作为氨氧化细菌的结果吻合［20］.此外，系统中还存在亚硝化单胞菌属(Nitrosomonas)，它是许多水生态系统中最常见的氨氧化菌类型［7］.

从图3(a)不同泳道的条带变化情况来看，亚硝化球菌(Nitrosococcus)仅出现在滤层100及300mm处，而与亚硝化单胞菌属(Nitrosomonas)相关的条带1、条带2所代表的氨氧化细菌仅在滤层下方出现.如何根据这些细菌的空间分布特点改进工艺条件以达到更好的脱氮效果，还有待于进一步的研究.

基于ANAMMOX菌16SrDNA序列构建的系统发育树见图5.树图的外源基因选取了常见的几种ANAMMOX菌.可以看出，条带6、7与Candidatus Kuenenia stuttgariensis遗传距离最近，这与之前报道的在一个特定的环境条件中，只可能有一种ANAMMOX菌会成为优势菌种的结果相一致［21］.Candidatus Kuenenia stuttgariensis属于浮霉菌属，是污水处理系统中除Candidatus Brocadia anammoxidans之外的典型的具有厌氧氨氧化活性的微生物［22－24］.存在于本系统中的ANAMMOX菌是CandidatusKueneniastuttgariensis而非Candidatus Brocadia anammoxidans，其原因在于本实验所用污水是用自来水加一定的无机盐配制而成，具有较高的盐离子浓度，而Candidatus Kuenenia stuttgariensis被认为是一种存在于淡水环境中，并对较高的盐离子浓度具有一定耐受性的ANAMMOX菌［21］，因此，Candidatus Kuenenia stuttgariensis成为系统中的优势ANAMMOX菌.

图4 基于amoA基因序列的系统发育树

图5 基于ANAMMOX菌16S rDNA序列的系统发育树

3 结论

1)上向流曝气生物滤池型CANON反应器中，滤层下方的氨氧化细菌的种类和数量远高于滤层上部;厌氧氨氧化菌的多样性几乎不随滤层高度发生变化，其数量沿着滤层自上而下有逐渐增强的趋势.

2)反应器中微生物形态多样，易成簇生长，其中以直径0.2～1.0 μm的球形及椭球形菌为主.

3)DNA测序结果表明，亚硝化球菌属(Nitrosococcus)和亚硝化单胞菌(Nitrosomonas)是反应器中的主要氨氧化细菌，而厌氧氨氧化菌与Candidatus Kuenenia stuttgariensis的相似度高达98%.

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