培养滤液MPT64抗原检测结核分枝杆菌复合群生长的效能分析

许婉华 黄业伦 刘燕文 胡丽环 罗少珍 孟繁荣 刘志辉

结核分枝杆菌复合群（Mycobacterium tuberculosiscomplex，MTBC）特异性分泌蛋白 MPT64的发现、免疫胶体金法检测方法的创立及相关检测试剂的成功研发，为分枝杆菌培养物的MTBC与非结核分枝杆菌（non－tuberculous mycobacteria，NTM）的鉴定带来了极大的便利［1－2］。笔者在应用 MPT64分泌蛋白检测鉴定MTBC的研究中还发现：不管是采用液体培养基还是固体培养基，只要有MTBC生长，在绝大多数情况下均可检测到MPT64分泌蛋白［3］。这就提示人们MPT64蛋白的分泌可以作为MTBC的生长指示而成为MTBC培养的检测标志物，而且目前的研究表明MPT64为MTBC早期分泌蛋白，应用其作为MTBC生长检测标志物可能具有快速的特点，笔者的初步研究结果证实了这一特点［4］。为进一步确证这一实验方法的检测效能，笔者进行了大样本量的对照研究，现报道如下。

材料和方法

一、临床样本来源

2010年8月至2010年12月我院结核病防治所门诊2064例患者送检的分枝杆菌分离培养标本，其中2012例痰标本、12例胸腔积液标本、40例支气管灌洗液标本。

二、仪器和试剂

仪器分析法采用BACTEC MGIT 960分枝杆菌快速培养系统；培养基应用仪器系统专用培养基（美国BD公司生产），主要成分为 Middlebrook 7H9；MPT64抗原免疫胶体金法检测试剂盒购自杭州创新生物检控技术有限公司。

三、研究方案设计

以目前人们公认检测性能优良的BACTEC MGIT 960分枝杆菌快速培养仪器法（简称“仪器法”）为参照，分析培养滤液MPT64抗原检测法（简称“MPT64检测法”）指示MTBC生长的准确性和快速性。考虑到MPT64检测法不能实现连续监测，则根据成本－效益原则将整个研究分为3个阶段：（1）参照国家关于新型实验方法临床验证强制性样本量要求，采用双盲方法对一定数量仪器法已经报告结果（包括阳性、阴性和污染）的分枝杆菌培养瓶培养滤液进行一次MPT64抗原检测，初步评估MPT64检测法的准确性。（2）在培养的第7、14、21、28、35、42天（即第1～6周末）与仪器法同步进行培养滤液MPT64抗原检测，以“周”为时间单位比较两种方法各周的累积阳性检出率（%），分析其快速性能。（3）综合前2个阶段的实验结果，以仪器法为参照标准，分析对于全部标本和仪器法阳性标本MPT64检测法的符合率（%），分析MPT64检测法的准确性。

四、实验方法

1．仪器法：主要实验步骤包括标本收集与前处理、标本接种、上机与仪器监测、仪器报告阳性标本的涂片确认及MTBC与NTM分群等。标本收集与前处理严格按BACTEC MGIT 960分枝杆菌快速培养仪推荐方法进行；仪器培养检测步骤按仪器说明书进行；仪器报告阳性者经涂片抗酸染色法确认，抗酸染色阳性者报告“有抗酸杆菌生长”，阴性者报告“污染”；MTBC与NTM分群应用对硝基苯甲酸（paranitrobenzoic acid，PNB）培养生长试验，1个月未见菌落生长者为MTBC。

2．MPT64检测法：按研究设计方案适时对培养滤液进行MPT64抗原检测，具体检测方法和结果判读按试剂盒说明书严格进行：在生物安全柜中，以无菌方法取培养液约0．1ml加入试剂检测孔中，15min后观察结果，1h内观察完毕；检测线和质量控制（简称“质控”）线均出现紫红色条带为阳性，质控线出现检测线未出现紫红色条带者为阴性，质控线未出现者表示试剂存在问题而必须重新检测。并且在第2研究阶段强调：在仪器系统监测时点间隔间（笔者的仪器设置整点为检测时点）取出适量标本，所取标本必须在监测时点间隔内完成检测操作并放回仪器系统，以免影响仪器对分枝杆菌生长的检测。在本实验研究中，纳入第1、2阶段研究的样本量分别为799例和1265例样本。

五、统计学处理

和仪器法比较：应用χ2检验对所有2064例样本检测结果进行统计学分析，并计算于全部标本和仪器法阳性标本MPT64检测法的符合率（%），评估MPT64检测法的准确度；以“周”为时间单位比较两种方法各周的累积阳性检出率（%），并应用t检验比较分析MPT64检测法的快速性。两种统计学方法均以P＜0．05为有统计学意义。

结 果

一、两种方法检测结果比较

对于2064例分枝杆菌培养的临床标本，仪器法报告298例MTBC、108例NTM、1521例培养阴性及137例污染（后三者即无MTBC生长），其中分别有279、6、0、2例 MPT64检测阳性，即 MPT64检测法可报告有MTBC生长，两者间差异无统计学意义（χ2＝0．12，P＝0．742）。与仪器法的总体一致性为98．69%（2037／2064），对仪器法报告为 MTBC者MPT64检测法的阳性率为93．62%（279／298），具有较高的阳性符合水平（表1）。

二、两种方法1～6周阳性检测结果比较

每周进行MPT64监测的1265例培养液样本中，两种方法均检测到MTBC者168例，其中：仪器法在培养1～6周仪器报告阳性率分别为25．60%（43／168）、66．67%（112／168）、92．26%（155／168）、98．21%（165／168）、98．81%（166／168）和100．00%（168／168），MPT64检测法的阳性检出率则分别为17．26% （29／168）、61．90% （104／168）、89．88%（151／168）、95．24%（160／168）、98．81%（166／168）和100．00%（168／168）。两者阳性报告时间差异无统计学意义（t＝1．68，P＝0．366）（表2）。

讨 论

创建准确、快速、简便、经济的结核病病原学实验诊断方法一直是人们追求的目标，但无论是以菌落生长为观察终点的传统固体培养方法、还是以监测分枝杆菌呼吸活动的各种仪器系统快速培养法、亦或是以特定基因序列为检测靶标的各类分子技术以及其他的实验技术（如噬菌体生物扩增法、变色培养基法等），迄今为止仍无一种实验方法尽如人意。本研究评估的MPT64检测法是否可以解决部分问题？目前鲜见同类文献报道。

从本研究检测结果看，无论是对于整体样本还是MTBC阳性样本，MPT64检测法和目前检测效能优良但实验费用不菲且需专门仪器的BACTEC MGIT 960分枝杆菌快速培养仪器法间具有高度的一致性，说明其准确性可以与仪器法相媲美。从阳性样本报告时间看，两者阳性报告时间非常接近，但仪器报告阳性时间并不能直接代表实验报告时间，实验报告时间还需加上抗酸杆菌确认、MTBC与NTM分群等实验时间，如本研究分群采用的PNB培养生长试验则需4周之久。因此，可以毫无疑问地认为MPT64检测法比仪器法更为快速。实验操作程序简单，MPT64检测法可直接报告“有MTBC生长”，不需要仪器法的后续步骤，且其实验操作本身也极其简单（只须以无菌方法取培养液0．1ml加入试剂检测孔中一个简单操作，15min后即可观察结果）。而且，MPT64检测法国内有上市的试剂盒，也不需要任何仪器设备，亦不需要仪器法的后续实验费用，与需要进口专门仪器与专用试剂的仪器法相比，检测费用相对较低，符合实验方法的经济性原则。另外，本研究仪器法报告为“NTM”或“污染”的245例样本中MPT64检测法有8例呈现阳性，也许可以认为其对与其他细菌混合生长的MTBC具有较强的甄别能力。综上所述，MPT64检测法具有准确、快速、简便、经济的特点，值得在临床中推广应用，尤其适合在基层医疗单位开展。

表1 2064例分枝杆菌培养滤液MPT64检测结果与仪器法检测比较（例）

表2 1265例分枝杆菌培养中168株MTBC在两种方法中的阳性检出时间（例）

当然，MPT64检测法也存在一定的缺陷，笔者认为至少有三：一是不能实现连续监测，在培养时间终点检测会大大影响其快速性，实施多时点检测则会较大增加实验成本；二是目前的研究表明一些MTBC菌株可能不分泌 MPT64蛋白［3，5］，这会相对降低本实验方法对MTBC的检测能力；三是不能检测样本中的NTM，丢失了分枝杆菌培养实验本来固有的部分临床意义。这些问题均值得进行深入研究，更加希望研究成果能够快速面世，以满足结核病临床诊疗的迫切需要。

［1］Abe C，Hirano K，Tomiyama T．Simple and rapid identifica－tion of theMycobacterium tuberculosiscomplex by immunochromatographic assay using anti－MPB64monoclonal antibodies．J Clin Microbio，1999，37（11）：3693－3697．

［2］Fabre M，Vong R，Gaillard T，et al．Evaluation of the SD BIOLINE TB Ag MPT64Rapid®for the diagnosis of tuberculosis．Pathol Biol（Paris），2011，59（1）：26－28．

［3］刘志辉，蔡杏珊，刘玉美，等．MPB64分泌蛋白检测鉴定结核分枝杆菌复合群的应用研究．国际呼吸杂志，2010，30（18）：1100－1103．

［4］何霞，谭守勇，罗春明，等．应用MPT64为靶标快速检测结核分枝杆菌生长的研究．广东医学，2010，31（2）：222－224．

［5］吴雪琼．结核分枝杆菌保护性抗原的研究进展．中华结核和呼吸杂志，2006，29（4）：340－342．