花园葱蜗牛形态学与PCR检测鉴定技术

肖 琼， 杨海芳， 艾洪木， 周卫川

（1.福建农林大学植物保护学院，福州 350002；2.福建出入境检验检疫局，国家软体动物检疫鉴定重点实验室，福州 350001；3.中国湿地博物馆，杭州 310013）

花园葱蜗牛形态学与PCR检测鉴定技术

肖 琼1，2， 杨海芳3， 艾洪木1， 周卫川2＊

（1.福建农林大学植物保护学院，福州 350002；2.福建出入境检验检疫局，国家软体动物检疫鉴定重点实验室，福州 350001；3.中国湿地博物馆，杭州 310013）

花园葱蜗牛（CepaeahortensisMüller）是我国新增的进境植物检疫性有害生物名录中的成员，该螺与近似种在贝壳形态上难以鉴别。本文应用贝壳、软体解剖和PCR技术相结合的方法，研究了花园葱蜗牛的检测鉴定技术，结果表明，PCR方法特异性强、灵敏度高、检测结果稳定，并与形态学鉴定结果一致，该方法为非软体动物分类专业的检疫人员检测鉴定花园葱蜗牛提供了快速简便的技术方法。

花园葱蜗牛； 植物检疫； PCR； 鉴定

花园葱蜗牛（CepaeahortensisMüller）隶属于软体动物门，腹足纲，柄眼目，大蜗牛科，葱蜗牛属，是我国新修订的进境植物检疫性有害生物名录中的成员之一，原产于欧洲，现已经入侵至北美［1－3］，该螺在我国尚未分布，加强检疫是防治该螺最为经济有效的技术措施。近年来，我国口岸从欧美进境的原木和集装箱以及箱内货物的木质包装材料中多次截获该蜗牛，表明该螺入侵的风险较大［4］。

花园葱蜗牛与其近似种，尤其是森林葱蜗牛（CepaeanemoralisLinnaeus）在贝壳形态上难以鉴别，历史上学名应用十分混乱，给我国的实际检疫工作造成了被动，也是世界各国检疫工作中共同面临的技术难题。最近20多年来，分子系统学飞速发展，即通过基因序列的比对和分析可以厘清物种的分类学地位［5－7］，因此可以应用贝壳、解剖和分子特征相结合的方法，对花园葱蜗牛及其近似种的分类学进行更为深入而详尽的研究，为花园葱蜗牛的快速准确鉴定提供新的技术手段。目前，软体动物分类专业的检疫人员相当匮乏，而PCR技术在国境口岸检疫部门已经普及，如果能设计出特异性引物用PCR扩增方法进行初选或鉴定，这个难题就迎刃而解。本文将应用形态学和分子生物学相结合的方法，研究花园葱蜗牛的检测鉴定技术。

1 材料与方法

1.1 材料

建立PCR检测方法的供试材料为花园葱蜗牛成螺，产地意大利。验证PCR方法的材料为各口岸局送鉴的软体动物，包括花园葱蜗牛、近似种森林葱蜗牛和其他蜗牛（表1）。

1.2 主要试剂

天根生化科技（北京）有限公司的血液／细胞／组织基因组DNA提取试剂盒；2×TaqPCR Master Mix（组成为0.1UTaqPolymerase／μL；500mol／L dNTP each；20mol／L Tris－HCl（pH 8.3）；100mol／L KCl；3 mol／L MgCl2；其他稳定剂和增强剂）、DNA Marker I均购自天根生化科技有限公司。

1.3 方法

1.3.1 样品的准备

取花园葱蜗牛的软体腹足部分约0.1g，加液氮研磨。

1.3.2 DNA模板的制备

利用TIANGEN组织基因组DNA提取试剂盒提取，按使用说明书操作提取DNA，置于－20℃保存备用。

1.3.3 引物设计与合成

将提取的花园葱蜗牛DNA，用无脊椎动物线粒体细胞色素C氧化酶Ⅰ（cytochrome oxidaseⅠ，COⅠ）这一基因特定区段的通用引物LCO－1490 5′－GGTCAACAACA ATCATAAAGATATTGG－3′；HCO－2198 5′－TAAACTTC AGGGTGACCAAAAAATCA－3′［17］扩增并测序，获得花园葱蜗牛COⅠ基因特定片段序列，然后用Primer 5和Oligo Demo 6软件，根据引物设计原则［18］设计花园葱蜗牛的物种特异性引物 HY（01）、HY（02）。引物由上海生工生物技术服务有限公司合成。

1.3.4 PCR扩增

PCR反应体系的总体积为20μL，其中2×TaqPCR Master Mix 10μL，引物各0.5μL，DNA模板2μL，然后加水至20μL。PCR反应条件为：95℃5min，95℃50s，55℃30s，72℃50s，35个循环，72℃10min。

1.3.5 特异性试验

以花园葱蜗牛为阳性对照，按试剂盒方法提取经形态学鉴定确认为森林葱蜗牛、散大蜗牛、盖罩大蜗牛、斯文豪大蜗牛和灰尖巴蜗牛的DNA，先用通用引物LCO－1490和 HCO－2198进行PCR扩增以证实DNA提取成功，然后再用特异性引物 HY（01）、HY（02）进行PCR扩增，经1.5%的琼脂糖凝胶电泳分析PCR产物，以检测该引物的特异性。

1.3.6 灵敏度试验

将花园葱蜗牛DNA模板进行104倍系列稀释：10－4倍，10－8倍，10－12倍，10－16倍，然后进行PCR扩增，以确定检测方法的灵敏度。

1.3.7 PCR检测鉴定方法的验证和应用

将各口岸局送鉴的软体动物（表1）用TIANGEN组织基因组DNA提取试剂盒，按使用说明书操作提取DNA，用设计的特异性引物HY（01）、HY（02）进行PCR扩增、电泳、条带鉴定，并与形态学鉴定结果比对，来验证该方法的准确性和稳定性。

2 结果与分析

2.1 花园葱蜗牛的分布

花园葱蜗牛主要分布中欧、北欧、冰岛和北美地区。分布的国家包括英国、德国、法国、荷兰、卢森堡、比利时、波兰、瑞典、挪威、芬兰和美国。在英国、德国、法国等欧洲国家是常见种［8－13］。

图1 花园葱蜗牛成螺贝壳形态特征

2.2 花园葱蜗牛贝壳和卵的形态特征

花园葱蜗牛成螺贝壳的主要鉴定特征为：贝壳扁球形，缓慢膨胀，有5～5.5个螺层，脐孔完全被唇缘覆盖。口唇白色粗短（偶尔有褐色）。贝壳色彩明亮，有光泽，其上有微弱而不规则的生长线和螺旋状的色带0～5条，故也称白唇彩带蜗牛。贝壳在颜色和色带数量方面变异很大。口唇是褐色的个体，在形态上难以与森林葱蜗牛相区别，一般来说，花园葱蜗牛贝壳更细薄一些，螺层更圆一些。壳高10～15mm，壳宽14～20mm（偶有22mm）［2，9－16］。

幼螺贝壳较小，壳质薄，易碎，形态特征与成螺贝壳基本一致。

卵圆形，白色，直径2mm 左右［2］。

2.3 花园葱蜗牛的解剖特征

阴茎长，阴茎本体与阴茎差不多等长，阴茎本体略带紫色。鞭状体细长。阴茎牵引肌薄而宽，中等长度。授精囊柄长，略粗。矢囊大，椭圆形，无副矢囊。黏液腺两枝，分别在阴道两侧，每枝二分叉，分叉后每枝又分2～3枝，即一支黏液腺有4～6个分支；黏液腺管状，粗实且长，光滑。阴道呈紫色（图2）。花园葱蜗牛与森林葱蜗牛生殖系统的区别在于：花园葱蜗牛的黏液腺每枝有大于等于4个分支，而森林葱蜗牛的黏液腺最多3个分支［2，13］；花园葱蜗牛恋矢的横切面是带二分叉的刀片状十字交叉，森林葱蜗牛恋矢的横切面是简单的刀片状十字交叉（图3）［12］。

2.4 花园葱蜗牛COⅠ基因的PCR扩增及序列测定结果

花园葱蜗牛COⅠ基因片段PCR产物大小为710bp，序列测定结果已登录到NCBI上，登录号为JQ235165。根据片段序列，用Primer 5和Oligo Demo 6软件设计出引物若干对，经过软件分析及退火温度试验，最终选择花园葱蜗牛的特异性引物为：

该对引物PCR产物的大小为453bp。

2.5 引物特异性扩增结果

用引物 HY（01）、HY（02）经PCR反应扩增花园葱蜗牛、森林葱蜗牛、散大蜗牛、盖罩大蜗牛、斯文豪大蜗牛、灰尖巴蜗牛，并设ddH2O为空白对照，只有花园葱蜗牛扩增出特异性片段，其他5种蜗牛和ddH2O对照均无特异性条带出现，试验结果与预期一致（图4），说明该引物具有良好的特异性。

图4 花园葱蜗牛引物特异性扩增结果

2.6 灵敏度试验结果

用紫外分光光度计测定提取的花园葱蜗牛DNA浓度为232ng／μL，将模板DNA按104倍系列稀释后进行PCR扩增，以ddH2O作为对照。结果显示，在稀释10－16倍后仍有微弱条带，（图5），说明此方法具有很高的灵敏度。

图5 花园葱蜗牛PCR灵敏度试验结果

2.7 PCR检测鉴定方法的验证与应用

对各口岸局送鉴的软体动物进行形态学鉴定和PCR检测方法比对。结果表明，形态学鉴定为花园葱蜗牛的全部出现明亮的条带，而形态学鉴定为其他种类的蜗牛均无出现条带，PCR检测结果与形态学鉴定相符合，表明此引物具有良好的特异性和稳定性，所建立的PCR检测方法可应用于花园葱蜗牛的实际检测鉴定工作（表1）。

表1 PCR检测方法与形态学鉴定的比对结果和实际应用

3 结论和讨论

目前，对花园葱蜗牛的鉴定主要是依据贝壳特征，而它的贝壳与同属的森林葱蜗牛极为相似，尤其是口唇为褐色的花园葱蜗牛个体，确实与森林葱蜗牛很难鉴别，即使是训练有素的陆生软体动物分类专家，也必须通过解剖软体的生殖系统才能鉴别。然而，迄今为止国内农业院校植物保护系既没有开设软体动物分类学专业课程，也没有专门的师资和研究力量，而目前口岸检疫工作主要是由植物保护专业的科技人员承担软体动物的检疫鉴定，造成了实际检疫鉴定工作的被动。近年来，PCR检测鉴定技术在国境口岸部门已相当普及，本文所建立的PCR方法为检测鉴定花园葱蜗牛提供了新的技术和方法，也为非软体动物分类专业的检疫人员提供了快速简便的检测方法。

本研究所设计的特异性引物HY（01）、HY（02）对花园葱蜗牛DNA进行PCR扩增，能扩增出与预期大小相符的条带，并且与森林葱蜗牛、散大蜗牛、盖罩大蜗牛、斯文豪大蜗牛和灰尖巴蜗牛进行对照，均无条带出现，建立了花园葱蜗牛的PCR检测鉴定方法，并在实际检疫工作中得到验证和应用。试验和应用表明，该方法特异、敏感、稳定。在实际检疫过程中，分类专家可根据贝壳形态进行初步鉴定，然后用PCR方法进行验证确认；对于非软体动物分类专业的科技人员，则可先用PCR方法进行初筛，确认为花园葱蜗牛的疑似种，再送分类专家进行最后确认，可确保鉴定结果准确可靠。

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Morphology and PCR identification technology ofCepaeahortensis

Xiao Qiong1，2， Yang Haifang3， Ai Hongmu1， Zhou Weichuan2
（1.CollegeofPlantProtection，FujianAgriculturalandForestryUniversity，Fuzhou350002，China；2.StateKeyLaboratoryofMolluscanQuarantineandIdentification，Fujian Entry－ExitInspection＆QuarantineBureau，Fuzhou350001，China；3.NationalWetlandMuseumofChina，Hangzhou310013，China）

CepaeahortensisMüller is one of the species in the import plant quarantine pest list.This species is difficult to be distinguished from similar species by the shell characters.In this study，the shell characters，anatomical method and PCR were used to identifyC.hortensis.The results showed that PCR method had high specificity，sensitivity and stability，and it could provide a quick and easy technical method for identification ofC.hortensis.

Cepaeahortensis； plant quarantine； PCR； identification

S 41

A

10.3969／j.issn.0529－1542.2012.05.022

2011－11－11

2011－12－07

福建省国际重点项目（201210001）；福建省自然科学基金项目（2012J01063）；国家自然科学基金项目（31040072）

＊ 通信作者E－mail：wczhou＠163.com