柑橘黑斑病菌生物学特性研究

卢松茂， 罗金水， 张汉荣， 余智城， 林智明， 林秀香

（福建省热带作物科学研究所，漳州 363001）

柑橘黑斑病菌生物学特性研究

卢松茂， 罗金水， 张汉荣， 余智城， 林智明， 林秀香

（福建省热带作物科学研究所，漳州 363001）

本文测定了不同培养基、温度、pH、光照条件对柑橘黑斑病菌柑橘叶点霉（Phyllostictacitricarpa）菌丝生长和孢子萌发的影响，以明确其生物学特性。结果表明，该菌最适生长的培养基为燕麦片琼脂培养基（OA）；菌丝最适生长温度为25～30℃，最适pH为5～7；在12h光暗交替条件下生长最好，全黑暗条件下生长最慢。分生孢子萌发最适温度为25℃，最适pH为6，以在0.2%葡萄糖溶液中的萌发率最高。菌丝和分生孢子在55℃水浴处理10min均失活。

柑橘黑斑病； 柑橘叶点霉； 生物学特性

致 谢： 本研究得到浙江大学农业与生物技术学院李红叶教授指导与帮助，谨表示衷心的感谢。

联系方式E－mail：songmaolu＠163.com

柑橘黑斑病（citrus black spot）是柑橘的一种重要病害，又名柑橘黑星病，在欧盟、美国等地是重要的对外检疫性有害生物。1895年由Benson［1］最早报道了该病害在澳大利亚新南威尔士州柑橘园的危害，现分布于非洲、亚洲、南美洲等许多国家和地区，在中国此病主要分布在广东、福建、浙江、江西、四川、湖南、湖北及台湾等地区［2］。该病由柑橘叶点霉［Phyllostictacitricarpa（McAlp.）Van der Aa］引起，有性态为柑果球座菌（GuignardiacitricarpaKiely）［3－4］，能 侵 染 危 害 金 柚［5］、沙 田 柚［6］、琯 溪 蜜柚［7］、苍南四季柚［8］、柠檬［9］等多种柑橘类植物的果实、叶片和枝梢，典型症状为病斑边缘呈红褐色或黑褐色，中部稍凹陷，灰色，散生黑色小粒点（分生孢子器），影响果实的外观和品质。近年来，该病害在全国最大的柚类鲜果生产基地和出口示范基地福建省平和县［10］琯溪蜜柚种植区发生危害形势日益严峻，果园发病率在10%～15%，严重的达30%以上，对柚果出口造成严重影响［11］。由于国内外尚未见该病原菌生物学特性系统研究的报道，因此，作者于2010－2011年对该病原菌的生物学特性进行了系统研究，以期为该病害的预测预报及防治提供理论依据。现将研究结果报道如下。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 供试菌株

柑橘叶点霉［Phyllostictacitricarpa（McAlp.）Van der Aa］由浙江大学农业与生物技术学院李红叶教授提供。用燕麦培养基（OA）在光暗交替（光照12h、黑暗12h）条件下25℃霉菌培养箱培养7d保存备用。

1.1.2 供试培养基［12］

燕麦培养基（OA）：燕麦片30g、琼脂粉7g、水1L；马铃薯葡萄糖培养基（PDA）：马铃薯200g、葡萄糖20g、琼脂粉7g、水1L；PDA＋柚叶汁培养基：马铃薯200g、葡萄糖20g、琼脂粉7g、20g柚叶（磨成汁）、水1L；麦芽膏培养基（MEA）：麦芽膏20g，琼脂粉7g，水1L；樱桃汁培养基 （CHA）：樱桃汁（200mL）、琼脂粉7g、水1L。将以上培养基分别分装于三角瓶中，在121℃下灭菌20min后备用。

1.2 方法

1.2.1 培养基对菌丝生长的影响

在PDA、OA、MEA、CHA、PDA＋柚叶汁培养基平板上，分别接种该病原菌菌丝，在25℃培养箱中光暗交替条件下培养，7d后观察菌落特征并采用十字交叉法测量菌株菌落大小。每个处理重复4次。

1.2.2 不同营养液对分生孢子萌发的影响

分别用0.2%葡萄糖溶液、0.2%α－乳糖溶液、10%柚叶汁和无菌水配制孢子悬浮液，在高倍镜下每个视野20～30个分生孢子，用移液枪吸取15μL溶液在单凹玻片上，置于25℃培养箱中保湿培养，18h后观察记录分生孢子萌发情况。每个处理观察200个分生孢子，重复3次。

1.2.3 温度对菌丝生长和分生孢子萌发的影响

在PDA培养基平板上，接种菌株菌丝，分别置于10、15、20、22、25、28、30、35、40 ℃霉菌培养箱中光暗交替培养。7d后观察菌落特征并采用十字交叉法测量菌落大小。每个处理重复4次。

用pH 6的0.2%葡萄糖溶液配制分生孢子悬浮液，在高倍镜下每个视野20～30个分生孢子，用移液枪吸取15μL溶液在单凹玻片上，置于15、20、22、25、28、30、35 ℃霉菌培养箱培中保湿培养，24h后观察记录分生孢子萌发情况。每个处理观察200个分生孢子，重复3次。

1.2.4 pH对菌丝生长和孢子萌发的影响

分别用1mol／L的盐酸和氢氧化钠溶液调节灭过菌的 OA培养基的pH 为3、4、5、6、7、8、9、10、11，每个培养皿倒入约15mL培养基，接种病原菌菌丝，置于25℃培养箱中光暗交替培养。7d后观察菌落特征，并采用十字交叉法测量菌落大小。每个处理重复4次。

分别用不同pH（3、4、5、6、7、8、9、10）的0.2%葡萄糖溶液配制分生孢子悬浮液［13］，在高倍镜下每个视野20～30个分生孢子，用移液枪吸取15μL溶液在单凹玻片上，置于25℃霉菌培养箱中保湿培养，24h后观察记录分生孢子萌发情况。每个处理观察200个分生孢子，重复3次。

1.2.5 光照对菌丝生长的影响

在PDA培养基平板上，接种病原菌菌丝，分别置于25℃培养箱中在完全光照、光暗交替、完全黑暗条件下培养。7d后观察菌落特征并采用十字交叉法测量菌落大小。每个处理重复4次。

1.2.6 菌丝、分生孢子致死温度测定

取未形成子实体的菌丝分装离心管分别置于45、50、55、60、65℃恒温水浴锅中水浴处理10min，再接种至OA平板培养基上置于25℃的培养箱培养，7d后观察菌落生长情况。每个处理重复4次。

用无菌水配制的孢子悬浮液倒入5个无菌的小试管（每管1mL），分别置于45、50、55、60、65℃的恒温水浴锅中水浴处理10min后，再接种至OA平板培养基上，置于霉菌培养箱25℃培养，7d后观察菌落生长情况。每个处理重复4次。

2 结果与分析

2.1 培养基对菌丝生长的影响

5种培养基中，OA培养基上菌落直径明显比其他4种大，且菌落颜色明显带黄色，其他培养基上则为黑色至灰黑色（图1）。PDA＋柚叶汁与PDA培养基菌落直径存在极显著差异，表明在PDA培养基上添加柚叶汁能促进该菌菌丝生长。PDA和MEA培养基菌落直径无明显差异，CHA培养基上最小。病原菌在5种培养基中培养15d后均能产生分生孢子（表1）。

图1 柑橘叶点霉在不同培养基上的菌落特征

表1 不同培养基对菌丝生长的影响（25℃）1）

2.2 不同培养液对分生孢子萌发的影响

分生孢子在4种营养液中孢子萌发率均未达到25%以上；在0.2%葡萄糖溶液中孢子萌发率最高（17%），0.2%α－乳糖溶液和10%柚叶汁液中的萌发率次之，在水中的萌发率最低（1%）（图2）。

2.3 温度对菌丝生长和孢子萌发的影响

病菌菌丝在10～35℃范围内均能生长，菌落颜色由淡黄色变为灰黑色或黑色。在10～25℃范围内，菌丝随着温度的升高生长速度逐渐加快。在25～40℃范围内，随着温度的升高菌丝生长速度逐渐减慢，40℃时菌丝停止生长。通过方差分析比较，菌丝在25～30℃范围内的生长速率与在其他温度上的存在极显著差异，可见最适宜菌丝生长的温度范围为25～30℃。低温（10、15℃）和高温（40℃）条件下菌落均不产孢，菌丝生长明显受抑制（表2）。分生孢子在15～35℃范围内均能萌发，在15～25℃范围内，孢子萌发率随温度升高而逐渐增大，25℃时孢子萌发率最大。在25～35℃范围内，孢子萌发率随温度升高而逐渐减小（图3）。

图2 培养液对分生孢子萌发的影响

2.4 pH对菌丝生长和孢子萌发的影响

菌丝在pH4～11范围都能生长，但在pH3时不能生长。结果分析表明，菌丝在pH5～7条件下的生长速率与其他pH上的存在极显著差异，可见最适宜菌丝生长的pH为5～7。在pH4～11范围内，培养7d后的菌落颜色随着pH的增大由黑色逐渐变为黄色。菌丝生长16d后均能产孢，但pH11的产孢最少（表3）。分生孢子在pH3～9范围内均能萌发，但pH10时不能萌发。

在pH3～6范围内，随着pH的增大孢子萌发率逐渐升高，到pH6时最高。在pH6～10范围内，随着pH增大，孢子萌发率逐渐降低（图4）。

图3 温度对分生孢子萌发的影响

表2 温度对菌丝生长和孢子萌发的影响（PDA）1）

表3 pH对菌丝生长的影响（OA，25℃）1）

2.5 光照对菌丝生长的影响

菌丝在12h光暗交替条件下生长最快，全光照生长次之，全黑暗生长最慢，但菌落颜色、菌落形态和产孢情况在3种处理中大致相同（表4）。

图4 pH对分生孢子萌发的影响

表4 光照对菌丝生长的影响（PDA，25℃）1）

2.6 菌丝、分生孢子致死温度测定

该病原菌菌丝和分生孢子经55℃以上水浴处理10min后，再转移至OA培养基上25℃下培养7d，均未见菌丝生长和菌落形成，而在45、50℃水浴处理10min后的菌丝和分生孢子仍具有活性（培养7d后可见菌丝生长），由此表明55℃水浴处理该菌菌丝和分生孢子10min可使其失活。

3 结论与讨论

本文系统研究了培养基、营养液、温度、pH和光照对柑橘叶点霉菌丝生长、分生孢子形成和分生孢子萌发的影响。研究结果表明，柑橘叶点霉菌丝在不同培养基上生长，其菌落特征有差异，在OA培养基上菌落为黄色至黄黑色，而其他4种培养基上菌落颜色均未见黄色，这与Baldassri［14］研究报道一致，同时，Baldassri还指出利用OA培养基能有效地从形态特征鉴别Guignardiacitricarpa和Guignardiamangiferae。然而，Baayen［15］研究认为，菌丝除了在OA生长会出现黄色外，在CHA和MEA上生长均可见淡黄色，这可能与不同菌株和培养条件有关。

菌丝能在较宽的温度范围（10～35℃）和pH范围（4～11）生长，表明该菌可能在自然条件下的适应性较强。Wager［16］研究认为菌丝在琼脂培养基上最适生长温度为24～27℃，这与笔者的研究结果较为吻合。在10℃时，菌丝生长明显受到抑制，与Agostini［17］的研究结果一致，进一步说明了果实采收后低温储藏能减缓果实病斑的发展。光照对菌丝生长也有影响，12h光暗交替条件最有利于菌丝生长，这表明田间向阳的果实或叶片可能更有利于病菌的生长。分生孢子萌发试验表明，该菌的分生孢子萌发率低，以在pH6的0.2%葡萄糖溶液中25℃下萌发最好，但Kiely［18］研究认为0.3%橘汁最适合分生孢子萌发，这可能与不同地区分生孢子特征及萌发营养液差异有关。

柑橘黑斑病是一种潜伏期很长的病害，从病原菌侵染成功到果实或叶片表现症状需要很长的时间。Baldassari［19］报道甜橘在人工接种成功后至少要55d才能初显发病症状。一旦病原菌侵入果实后，在果实成熟期病斑会大量出现，将给果农带来巨大的损失。Agostini提出了果实生长季节的化学防治措施和8℃的储藏温度能有效减少果实病斑的出现。因此，在生产实践中，应结合病原菌的生物学特性，做好果实前期的病害预防工作，减少病源；在果实采收后，应注意保存的条件。目前，国内外有关柑橘黑斑病菌潜伏侵染机制尚不明确，有待今后进一步研究。

［1］Benson A H.Black spot of the orange［J］.Agricultural Gazette of New South Wales，1895，6：249－251.

［2］张汉荣，罗金水，李美桂.国内外柑桔黑斑病研究进展［J］.中国农学通报，2011，27（6）：40－44.

［3］Van der A A H A.Studies inPhyllosticta［J］.Studies in Mycology，1973，5：1－110.

［4］陆家云.植物病原真菌学［M］.北京：中国农业出版社，2001：200.

［5］郭碧云，郑峰，吴水欣，等.金柚黑斑病的发生特点及防治技术［J］.中国南方果树，2006，35（4）：21.

［6］罗向群.沙田柚黑斑病的发生情况及防治措施［J］.植保技术与推广，2002，22（2）：19－22.

［7］黄德平，熊森基，黄利敏.梅县琯溪蜜柚黑斑病的发生与防治对策［J］.中国南方果树，2009，38（2）：45.

［8］潘孝强，黄为杰.苍南四季柚黑斑病的发生及防治技术［J］.浙江柑橘，2009，26（3）：30－32.

［9］肖育贵，周建华，吕良琼，等.柠檬黑星病的初步研究［J］.四川农业大学学报，2004，22（2）：153－156.

［10］黄天瑞，张汉荣.琯溪蜜柚标准化栽培技术［J］.福建热作科技，2011，36（1）：39.

［11］罗金水，张汉荣，卢松茂，等.琯溪蜜柚黑斑病菌分离鉴定及其致病性测定［J］.福建热作科技，2011，36（4）：1－5.

［12］方中达.植病研究方法［M］.第3版.北京：中国农业出版社，1998：46－49.

［13］许志刚.普通植物病理学实验指导［M］.中国农业出版社，2003，74－75.

［14］Baldassri R B，Wickert E，Goes A de.Pathogenicity，colony morphology and diversity of isolates ofGuignardiacitricarpaandG.mangiferaeisolated fromCitrusspp.［J］.European Journal of Plant Pathology，2008，120：103－110.

［15］Baayen R P，Bonants P J M，Verkley G，et al.Nonpathogenic isolates of the Citrus black spot fungus，Guignardiacitricarpa，identified as a cosmopolitan endophyte of woody plants，G.mangiferae（Phyllostictacapitalensis）［J］.Phytopathology，2002，92（5）：464－477.

［16］Wager V A.The black spot disease of citrus in South Africa［J］.Science Bulletin，Department of Agriculture，Union of South Africa，1952，303：1－52.

［17］Agostini J P，Mackenzie S J，Adaskaveg J E.Effect of fungicides and storage conditions on postharvest development of Citrus black spot and survival ofGuignardiacitricarpain fruit tissues［J］.Plant Disease，2006，90（11）：1419－1424.

［18］Kiely T B.Preliminary studies ofGuignardiacitricarpan.sp.the ascigerous state ofPhomacitricarpaMcAlp.and its relation to black spot of citrus［J］.Proceedings of the Linnean Society of New South Wales，1949，73：249－292.

［19］Baldassari R B，Reis R F，Goes A de.A new method for inoculation of fruit withGuignardiacitricarpa，the causal agent of citrus black spot［J］.European Journal of Plant Pathology，2009，123：1－4.

Biological characteristics of the pathogen of citrus black spot

Lu Songmao， Luo Jinshui， Zhang Hanrong， Yu Zhicheng， Lin Zhiming， Lin Xiuxiang
（FujianInstituteofTropicalCrops，Zhangzhou363001，China）

The effects of different media，temperatures，pH and lights on mycelial growth and conidial germination were tested to understand the biological characteristics ofPhyllostictacitricarpa（McAlp.）Van der Aa causing the citrus black spot.The results showed that the optimum medium for mycelial growth was oatmeal agar（OA）.For mycelial growth，the optimum temperature was 25－30℃，and the optimum pH was 5－7.It grew the fastest under alternate light and darkness every 12 hours，but the slowest in darkness.The optimum temperature for conidial germination was 25℃，and the optimum pH was 6.If the conidia grew in0.2%glucose solutions，the percentage of conidial germination was the highest.The lethal temperature for the conidium and mycelium was 55℃，lasting for 10 minutes.

citrus black spot；Phyllostictacitricarpa； biological characteristics

S 436.661.1

A

10.3969／j.issn.0529－1542.2012.05.009

2012－01－31

2012－02－29

福建省公益类基本科研专项（2009R10010－1）；福建省自然科学基金项目（2010J01113）