总黄酮醇苷检测条件的研究

晋 静

（山西千汇药业有限公司，山西 太原 030032）

1 仪器和试剂

（1）仪器：LC-10AT高效液相色谱仪。

（2）试剂：槲皮素、山柰素、异鼠李素对照品（均为中国药品生物制品检定所提供）；银杏酮酯滴丸（山西千汇药业有限公司，批号 090301，080401，080701）；甲醇、乙腈为色谱纯；水为自制超纯水；其他试剂均为分析纯。

2 方法与结果

2.1 色谱条件

色谱柱 luna 5u C18（2）100A（200 mm×4.60 mm，5micron）；流动相：水（0.5%冰醋酸-0.1%三乙胺）：乙腈=70∶30；检测波长368 nm；流量 0.8 mL/min；柱温：30 ℃；进样量：20 uL。理论塔板数按槲皮素计应不低于2 500；山柰素与异鼠李素峰分离度应大于1.5。

2.2 供试品溶液及对照品溶液的制备

取本品50丸，精密称定，研细。精密称定约相当于总黄酮醇苷19.2 mg的该粉末，精密加入甲醇20 mL，称定重量，超声处理（50 W，50 kHz，起始浴温 25℃）20 min，放冷，再称定重量。用甲醇补足缺失的重量，摇匀，滤过，精密量取续滤液10mL，置100mL锥形瓶中，加甲醇10 mL，25%盐酸溶液5 mL，摇匀，置水浴中加热回流30 min，迅速冷却至室温，转移至100 mL量瓶中，用甲醇稀释至刻度，摇匀，用微孔滤膜（0.45 μm）滤过，取滤液即得。另分别称取经P2O2二燥过夜的槲皮素、山柰素、异鼠李素对照品，置同一100 mL量瓶中，加甲醇溶解，并稀释至刻度，摇匀即得。

2.3 空白干扰试验

空白干扰试验，取相应的辅料适量，按供试品溶液的制备方法制备阴性对照溶液，分别精密吸取供试品溶液、对照品溶液、阴性对照溶液各20 uL，按上述色谱条件测定，见图1，按药典标准，见图2。结果：样品中槲皮素、山奈素、异鼠李素与其他组分离较好且阴性对照在相应的位置无干扰。

2.4 标准曲线的制备

精密称取槲皮素对照品10.36 mg，山奈素对照品10.74 mg，分别置于25 mL量瓶中，加甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀。精密称取异鼠李素对照品12.73 mg，置50 mL量瓶中，加甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀。分别精密吸取 0.5 mL、1.0 mL、2.0 mL、3.0 mL、4.0 mL、5.0 mL置50 mL量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀。按上述色谱条件测定，分别进样20 uL，测得峰面积积分值。以对照品的浓度为横坐标，峰面积积分值为纵坐标，绘制标准曲线。结果表明，槲皮素在4.144～41.44范围内呈良好线性关系，回归方程：Y=54.09X-31.23；山奈素在4.296～42.96范围内呈良好线性关系，回归方程：Y=57.41X-15.64；异鼠李素浓度在2.546～25.46范围内呈良好线性关系，回归方程：Y=59.75X-26.38。

图1 空白干扰本试验对照

图2 药典用流动相对照

2.5 稳定性试验

精密吸取同一供试品溶液，按上述色谱条件，每隔一段时间进样1次，测得其峰面积积分值，见图3，按药典标准，见图4。结果表明，供试品溶液24 h内基本稳定，数据见表1。

图3 稳定性试验样品

图4 药典用流动相样品

表1 供试品溶液24 h数据

2.6 精密度试验

精密吸取对照品溶液，按上述色谱条件，连续进样5次，测得峰面积积分值，见表2。

2.7 重复性试验

取同一批号（080401）供试品，按供试品溶液制备方法平行制5份，按上述色谱条件测得其含量分别为:1.44mg/丸，1.43mg/丸，1.40 mg/丸，1.42 mg/丸，1.36 mg/丸；RSD值为 2.24%。

表2 连续进样5次

2.8 加样回收率试验

精密称取已知含量的样品（批号：080401，含量：1.44 mg/丸）适量，精密加入槲皮素、山奈素、异鼠李素混合对照品溶20 mL（浓度分别为：54.5 ug/mL、27.8 ug/mL、20.4 ug/mL），依法操作，按总黄酮醇苷含量=（槲皮素含量+山奈素含量+异鼠李素含量）×2.51计算，见表3。

表3 回收率试验

3 结论

本实验条件与用甲醇：0.4%磷酸溶液（50∶50）作流动相的比较，不仅峰形较好，而且样品图谱中槲皮素、山柰素之间的小峰与主峰的分离度也较好。