TRAIL联合顺铂诱导非小细胞肺癌细胞凋亡的作用

郑中华 国 巍 于洪泉 郭 敏 丁丽娟 赵丽微 齐 玲

(吉林医药学院病理学教研室，吉林 吉林 132013)

肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体(TRAIL)是体内天然的抗肿瘤药物，可由人体的免疫系统正常表达，目前在美国TRAIL已进入临床Ⅱ期研究阶段〔1〕。本课题组在以往研究中发现，TRAIL在胶质母细胞瘤诱导凋亡过程中，发生凋亡抵抗而不能引起肿瘤细胞凋亡〔2〕。因此，本文将研究TRAIL和化疗药物顺铂对非小细胞肺癌细胞联合诱导凋亡的作用，为TRAIL作为新药开发提供更进一步的理论依据，此方面研究国内还未见相关报道。

1 材料与方法

1.1 细胞培养 从液氮中取出冻存的非小细胞肺癌细胞H596细胞株，37℃水浴后离心弃上清，将细胞用含10%小牛血清的RPMI 1640(美国Gibco公司)培养液，在37℃，5%CO2及饱和湿度下培养，隔日换液，1∶3传代。

1.2 TRAIL和顺铂作用细胞后细胞死亡率检测〔3〕待细胞生长至90%时，用0.25%胰酶消化成单细胞悬液，以每孔8×103个细胞密度种于96孔培养板中，培养24 h后单独加入rhTRAIL(英国Peprotech公司，药物终浓度分别为0、0.01、0.1、1、10和100 ng/ml)或与10μg/ml顺铂联合作用，24 h后弃上清，0.01 mol/L PBS洗板，加入新鲜配制的酸性磷酸酶底物检测溶液(上海生物工程技术公司)100μl，继续培养90 min，每孔加入0.1 mol/L氢氧化钠10μl室温孵育5 min。酶标仪405 nm处测定各孔吸光度(A)值，计算细胞死亡率 =(1－100 ×A405测定组/A405对照组)×100%。

1.3 统计学分析 采用SPSS17.0软件进行分析，结果以x±s表示，采用t检验。

2 结果

TRAIL(0.01、0.1、1、10、和 100 ng/ml)单独或与10 μg/ml顺铂联合作用细胞24 h，通过酸性磷酸酶法分析结果显示:TRAIL单独作用时，TRAIL浓度为1 ng/ml时，细胞出现死亡，死亡率为4.37%;随着药物浓度升高，细胞死亡率增加，10和100 ng/ml组细胞死亡率可达到13.15%和19.33%，与对照组相比有显著性差异(P＜0.05);加入顺铂后可以明显提高细胞的死亡率，0.1 ng/ml时细胞就会出现死亡，以后随着TRAIL药物浓度升高，死亡率仍增加明显，与对照组相比有显著性差异(P＜0.05或 P＜0.01)，见表1。

表1 TRAIL联合顺铂诱导非小细胞肺癌细胞凋亡的作用(x±s)

3 讨论

TRAIL是肿瘤坏死因子超家族中的成员之一，它能诱导多种肿瘤细胞发生凋亡，而对正常组织和细胞则无明显毒性作用〔1〕。TRAIL选择性诱导肿瘤细胞凋亡而不损伤正常细胞的特点，使其成为一种近年来研究较多的潜在的抗肿瘤药物〔4，5〕。TRAIL作用于细胞后，与细胞表面的死亡受体(DR)4或DR5结合后，结合细胞内的Fas相关死亡结构域(FADD)，再募集半胱氨酸蛋白酶8，使半胱氨酸蛋白酶8发生活化〔6，7〕，引起细胞死亡。化疗药物可以非特异性的与肿瘤细胞结合，化疗药物在应用治疗量时，也会引起广泛的化疗副反应。最近的研究显示，非毒性剂量的化疗药物可以增加TRAIL对肿瘤细胞诱导凋亡作用〔8〕。也有一些明显的证据表明，TRAIL可以作为治疗非小细胞肺癌的药物，尤其是与化疗药物联合作用时可以克服TRAIL抵抗作用〔9〕。

本实验采用非小细胞肺癌细胞H596细胞株，应用不同浓度TRAIL单独作用24 h后发现:从1 ng/ml TRAIL组开始，随着药物浓度升高，细胞死亡率开始增加，10和100 ng/ml组细胞凋亡水平增加较为明显，与对照组相比有统计学意义。应用不同浓度TRAIL联合顺铂作用24 h后发现:加入顺铂后可以明显提高细胞的死亡率，0.1 ng/ml细胞就会出现死亡，随着TRAIL药物浓度升高，死亡率增加明显(P＜0.05或P＜0.01)。说明顺铂可以增加TRAIL对非小细胞肺癌的诱导凋亡作用，但还需要进一步深入研究两者作用的机制。

1 Anita C，Ling Qi，Mulligan P，et al.TRAIL agonists on clinical trials for cancer therapy:the promises and the challenges〔J〕.Rev Recent Clin Trials，(Online)，2009;(4):34-41.

2 Li YC，Tzeng CC，Song JH，et al.Genomic alterations in human malignant glioma cells associate with the cell resistance to the combination treatment with tumor necrosis factor-related apoptosis-inducing ligand and chemotherapy〔J〕.Clin Cancer Res，2006;12(9):2716-29.

3 齐 玲，于洪泉，丁丽娟，等.Caspase-8在胶质母细胞瘤抵抗TRAIL诱导凋亡中的作用〔J〕.吉林大学学报(医学版)，2011;37(4):612-6.

4 Walczak H，Miller RE，Ariail K，et al.Tumoricidal activity of tumor necrosis factor-related apoptosis-inducing ligand in vivo〔J〕.Nat Med，1999;5(2):157-63.

5 Ashkenazi A.Targeting death and decoy receptors of the tumour-necrosis factor superfamily〔J〕.Nat Rev Cancer，2002;2(6):420-30.

6 南栗岩，齐 玲，肖振晶，等.原代培养的恶性胶质瘤细胞表达死亡受体与TRAIL抵抗的关系〔J〕.中国老年学杂志，2011;9(31):3591-2.

7 Bellail AC，Tse MC，Song JH，et al.DR5-mediated DISC controls caspase-8 cleavage and initiation of apoptosis in human glioblastomas〔J〕.JCell Mol Med，2010;14(6A):1303-17.

8 Song JH，Tse MC，Bellail A，et al.Lipid rafts and nonrafts mediate tumor necrosis factor related apoptosis inducing ligand induced apoptotic and nonapoptotic signals in non small cell lung carcinoma cells〔J〕.Cancer Res，2007;67(14):6946.

9 Gajewski TF.On the TRAIL toward death receptor based cancer therapeutics〔J〕.J Clin Oncol， 2007;25:1305.