单股正链RNA病毒基因组非编码区结构与功能研究进展

哲名家，陈宗艳，李传峰，刘光清

(中国农业科学院上海兽医研究所，上海 200241)

单股正链RNA病毒是一类成员众多的病毒大家族，其成员可以感染几乎所有的动物和植物，如由冠状病毒引起的非典型性肺炎，由脊髓灰质炎病毒导致的小儿麻痹症，由丙型肝炎病毒（Hepatitis type C virus，HCV）引发的非A 非B病毒型肝炎，由口蹄疫病毒（Foot-and-mouth disease virus, FMDV）造成的动物口蹄疫，由乙型脑炎病毒引发的人和动物的流行性脑炎等。由此可见，尽快找到治疗、预防和控制RNA病毒性传染病的药物、疫苗或措施已成为国内外科学家亟需解决的问题。要消灭病毒，首先要了解病毒，包括病毒的复制、表达和包装等生命周期各个阶段的特点。在漫长的生物演化过程中，为了节约有限的基因资源、进行高效的表达和复制，单股正链RNA病毒逐渐形成了一些可以自主调控病毒基因表达和复制功能的特殊性元件，即所谓的RNA顺式作用元件（cis-acting RNA elements），包括保守的一级核苷酸序列和复杂的RNA高级结构。大量研究资料表明，单股正链RNA病毒基因组末端的非编码区（non-coding region，NCR）往往存在一些重要的顺式调控元件，它们不仅参与RNA-RNA间相互作用，还可以通过与反式作用因子（transacting factor）结合，发挥对病毒基因组的复制、转录和组装等过程的调控作用。本文就近年来一些关于单股正链RNA病毒基因组非编码区的结构与功能研究进展情况进行综述。

1 5'/3'NCR含有的特征性序列/结构元件

1.1 茎环结构 单股正链RNA病毒基因组5'/3'NCR内部的核苷酸常发生回文现象，多呈发夹样茎-环结 构（stem-loop structure，SL）， 属 于RNA二级结构。其中，茎区（stem）是RNA分子内部反向重复序列通过碱基配对形成的双链区，而环区（loop）则是未配对的单链区。该结构具有生物学功能，比如招募细胞因子，调控病毒复制和蛋白翻译等过程。目前研究多集中在单链环区序列的特异性、双链茎区的稳定性以及茎环结构的相对位置等。

1.2 核糖体内部进入位点（internal ribosomal entry site，IRES） 已有两种蛋白质翻译机制得到证实：一是真核生物多采取依赖于 RNA基因组5'端 m7 GpppN 帽子结构的方式起始蛋白翻译。二是某些病毒的RNA基因组虽然缺乏帽子结构但却以一种奇特的方式起始蛋白翻译，例如脑心肌炎病 毒 (Encephalomyocarditis virus，EMCV) 5' NCR无帽子结构却拥有一段约534个核苷酸组成的一组RNA序列元件，它可以独立招募核糖体起始蛋白的翻译，正是凭借这一特殊元件，该病毒才能够介导核糖体使之进入 mRNA内彼此结合，起始病毒蛋白质的翻译。因此，这种只对于自身基因组起作用的称为顺式（cis）的RNA作用元件被称为内部核糖体进入位点（internal ribosome entry site,IRES）[1]。

依据其结构和功能，可将IRES归为四种类型：Ⅰ型多见于肠道病毒属(Enterovirus)和鼻病毒属(Rhinovirus)，以脊髓灰质炎病毒（Poliovirus，PV）为典型代表；Ⅱ型多见于心病毒属(Cardiovirus)和口疮病毒属(Aphthovirus)，以EMCV 为典型代表；Ⅲ型仅见于肝病毒属(Hepatovirus)的甲型肝炎病毒(Hapatitis A virus,HAV )；Ⅳ类型多见于丙型肝炎病毒属(Hepacivirus) 和瘟病毒属(Pestivirus)，分别以丙型肝炎病毒(Hapatitis C virus，HCV )和猪瘟病毒(Classical swine fever virus，CSFV)为代表[2]（图 1）

图 1 内部核糖体进入位点四种类型Fig.1 Four types of internal ribosome-entry site (IRES) elements

在HCV的5' NCR中，含有IRES元件的Ⅱa区能为顶端区域与核糖体亚基互相作用提供合适的作用平台。同样含有IRES的Ⅲ区和Ⅳ区为细胞翻译起始因子（eukaryotic initiation factors，eIFs）与核糖体亚基的结合提供了作用平台[3]。Ⅰ-Ⅲ型IRES元件包含有一段富含嘧啶碱基序列（Yn），后面紧随约15～20个左右的核苷酸（Xm） 及 AUG，并且高度保守[4]。研究表明，完整基序对于IRES发挥功能至关重要。据推测，YnXmAUG 基序可能充当小核糖体亚基的附着位点，与肠病毒属和EMCV不同的是存在于心病毒属的泰勒病毒中的YnXmAUG基序在进行体外翻译以及病毒复制都是不可或缺的[5]。1.3 假节结构（pseudoknot ，Pk） 自 1982年在黄萝卜花叶病病毒中发现以来，假节结构才得到足够认识，其本质是由不同茎环结构的单链环之间发生互补配对而构成的三级结构。例如，在博卡病毒（Kobuvirus）、肠道病毒（Enterovirus）以及FMDV等基因组5'/3'两端发现有一至数个假节结构存在。有趣的是，相吻作用（kissing interaction）就属于假节结构中的典型代表。脊髓灰质炎病毒（Poliovirus, PV）的3' NCR中X和Y两茎环的单链环区各有六个碱基发生互补关系存在相吻作用（图2）[6]。但受条件所限，至今对于假节结构的了解仍然不清楚，据推测这种特殊的RNA元件可能为翻译起始因子和核糖体相互识别而提供了作用结合位点，也可能起到激活IRES活性最终达到影响病毒翻译过程的目的[7]。

图2 脊髓灰质炎病毒（PV）的3'NCR中存在假节结构Fig.2 The pseudoknot(Pk)in the 3'NCR of Poliovirus（PV）

2 5'NCR高级结构与功能的关系

2.1 5' NCR对病毒基因组复制的调控 Witwer等[8]发现5'NCR 与单股正链RNA病毒的复制关系十分甚为密切。在肠道病毒5'NCR中存在着大量高度保守的RNA顺式作用元件。其中一个非常明显形似“四叶式苜蓿草样茎环结构（cloverleaf,CL）”，它内部的信号元件相互重叠被视为具有调节功能的关键性开关作用，参与调控病毒蛋白翻译以及RNA复制。例如，当宿主细胞蛋白PCBP2和病毒聚合酶前体蛋白3CDpro分别与四叶式苜蓿草样茎环结构（CL）的分支SL-B和SL-D相互作用[9]后所产生的结果迥然不同，前者能极大增强病毒蛋白翻译的效率；而后者将抑制病毒蛋白的翻译，同时促进负链RNA的合成。因此，Andrea等[10]推测这些存在于RNA元件内的四叶式苜蓿草样茎环结构（CL）可能携带病毒翻译和复制的信号，当它与细胞蛋白（PCBP2）等结合后，将以核糖核酸蛋白复合物（ribonucleoprotein，RNP）的形式来调控病毒蛋白翻译和RNA复制。

此外，Herold和Andino[11]又提出了一种模型（图3），即在合成负链RNA之前，脊髓灰质炎病毒（PV）基因组5' /3'端可发生环化作用，其中poly(A)结合蛋白（poly(A) binding protein，PABP）发挥中间桥梁的作用，其他两端分别与poly(A)尾和核糖核酸蛋白复合物(RNP)相连并产生相互作用。显然，核糖核酸蛋白复合物(RNP)对于促进病毒复制和增殖来说都是必需的。

图 3 脊髓灰质炎病毒基因组末端序列环化模型Fig.3 The model of Poliovirus（PV）genome circularizes in the 5'/3'NCR

FMDV基因组5' NCR顶端存在一个大的茎环结构称为S片段（S fragment），Serrano等[12]通过体外实验已证实，该S片段与poly(A)尾在体外存在相互作用。因此推测该S片段可能在RNA复制中发挥一定作用。研究表明，丙型肝炎病毒（HCV）的IRES总共有3个区域（区域Ⅱ-Ⅳ）。Kim等[13]已证实丙型肝炎病毒（HCV）基因组前40个碱基（包括区域Ⅰ）和IRES中的区域Ⅱ对于病毒基因组复制都是必要的。而IRES另外两个区域（区域Ⅲ和区域Ⅳ）虽不是复制所必需，但能辅助前两个区域进行复制，影响到RNA复制的效率。Friebe等[14]通过研究发现，虽然丙型肝炎病毒（HCV）5' NCR的前125个碱基对于RNA复制很关键，但其5' NCR的完整性对于基因组RNA能否高效地进行复制来说极其重要。

2.2 5' NCR对病毒基因组转录的调控 马动脉炎病毒（Equine arteritis virus，EAV）基因组RNA和亚基因组RNA的5'NCR中包括一个前导序列（leader）。EAV 5'末端313个碱基对于病毒翻译、RNA复制和亚基因组的合成都是必需的[15]。在5'NCR中，RNA通过折叠形成高级结构，其中包括五个茎环结构（SL A-E）、一段富含嘧啶碱基片段，其后还有五个茎环结构（SL F-J）[16]，它们分别位于基因组前导序列及部分ORF1a内。茎环G在前导序列中，其上有保守性的转录调控序列（transcription-regulating sequence，TRS），另外在ORF1b下游也存在一个与之互补的TRS（“body”TRSs）。二者之间的相互作用对于亚基因组的合成十分必要[17]。

2.3 5'NCR对病毒基因组翻译的调控 实验证明，小RNA病毒科甲型肝炎病毒（Hepatitis A virus，HAV）5'NCR中存在一些类似口疮病毒属和心病毒属的顺式作用元件[18]，其中就包括核糖体内部进入位点（IRES），它在病毒蛋白的翻译起始过程中发挥重要作用。此外，还发现HAV 5'NCR与宿主细胞的三磷酸甘油醛脱氢酶（GAPDH）存在相互作用，参与调节蛋白的翻译[19]。另据报道称，病毒蛋白前体3ABC在体外能结合到5'NCR上[20]。在HCV靠近5' NCR的核心编码区中存在两个保守的茎环结构（SL-Ⅴ和SL-Ⅵ），二者可能通过降低5'NCR和核心编码区之间的抑制作用来激活IRES元件的功能[21]。最近有研究表明，在SL-Ⅵ的5'端（428～442 nt）和5' NCR中的24～38 nt序列间存在相互作用，这对依赖IRES的翻译机制十分重要[22]。

2.4 5' NCR参与的RNA-RNA/protein相互作用登革热病毒（Dengue virus，DENV）5' NCR中存在一个大的茎环（SLA）,它的作用可能是促进负链RNA的合成[23]。位于SLA下游有一段富含U的保守序列，其作用是在转染的细胞中调控RNA合成。另外，靠近起始密码子处还有一个小发夹结构（SLB），该作用元件又包括一个5'端上游AUG区域，它与3'UAR存在碱基互补关系。此外，在5'端编码蛋白C的环化序列（5'CS）和3'茎环结构中的环化序列（3'CS）之间也具有互补碱基。这种发生在基因组两末端的长距离相互作用和环化作用已得到证实，可见它们对于DENV的RNA复制有重要作用[24]。

3 3'NCR内高级结构与功能的关系

3.1 3' NCR对病毒基因组复制的调控 小RNA病毒科3'NCR内存在一级和高级结构， Rohll等[25]已发现，FMDV 3'NCR 的 74 个核苷酸缺失后导致病毒 RNA的复制效率降低，说明3'NCR 在病毒复制过程中具有重要作用，可能参与了正链与负链合成的起始。又如PV 3' NCR具有两个茎环结构（X和Y），研究发现X茎环与poly(A)尾之间存在碱基配对关系，因此推测PV 3'NCR与poly(A)尾一起共同构成负链RNA合成的复制起始位点[26]。另据报道PV的3'NCR中X和Y两茎环的单链环区各有六个碱基存在相吻作用(kissing interaction)[27]。Brown等[28]通过对PV3'NCR序列进行突变后证实，破坏此结构后基因组和亚基因组RNA的复制水平将有所降低，但并不会影响到RNA的正常翻译。

令人惊讶的是同属的鼻病毒14（Rhinovirus 14）能够替代PV的 3'NCR[29]，表明PV的3Dpol与自身基因组RNA之间在复制过程中不存在特殊依存关系。另据报道，即使删除PV的3' NCR之后，也不会影响PV在Hela细胞中的生长，只是抑制了病毒负链RNA的合成[30]，提示PV的3' NCR可能有关键性的RNA顺式作用元件，保证了起始负链RNA合成的精准性。

尽管PV和肠道病毒属其他成员的poly(A)尾长约90 nt，但与之互补的poly(U)却只有20 nt[31]，这与之前研究是相符的，即poly(A)尾中只有20个核苷酸对于PV的复制和与PABP结合才是必需的[32]。HCV的3'NCR内含有三个区域，分别为可变区（VR）、poly(U/UC)和高度保守的3'X尾。其中3'X尾又包括三个茎环结构SL1、SL2和SL3。Yi等[33]通过缺失突变HCV亚基因组RNA复制子N端，发现3'NCR大部分序列中（包括3' X尾及poly(U/UC)）含有参与RNA复制的重要调控元件。虽然3'NCR的其余序列对于复制并不是必需的，但它能够增强RNA的复制水平。另有研究发现3'X尾和poly(U/UC)在病毒的感染性方面也发挥一定作用[34]。

研究表明，位于HCV基因组3' NCR上游具有RNA聚合酶活性的非结构蛋白（NS5B）的C端编码区内存在一个高度保守的稳定的茎环结构SL-Ⅴ，对RNA复制十分重要[35]。研究发现，纯化的NS5B能够与SL-Ⅴ特异性结合[36]。You等[37]也认为，SL-Ⅴ作为RNA顺式作用元件在HCV复制中发挥了重要作用，将SL-Ⅴ移到3'NCR中，结果导致病毒RNA的复制效率降低。此外，SL-Ⅴ顶端环与位于3'NCR 内的SL-2上的环区还存在相吻作用[38]。正是这一假结结构利用不同茎环间的碱基互补配对方式来达到修正病毒RNA复制的目的。还有研究认为，一或多个反式作用因子可与保守的X尾存在相互作用，这可能增强相吻作用[39]。Diviney等[40]推测，SL-Ⅴ中的环结构与NS5B上游约200个核苷酸的未配对序列可能存在着长距离的相互作用。

黄病毒属的3'NCR比较特殊，如DENV 3'NCR区域Ⅱ包括保守序列和两个茎环结构（A2和A3），在茎环上还存在一个形似哑铃状的保守序列元件[41]。若缺失A2或A3后会减弱病毒RNA的复制水平。最保守的区域III也含有一个稳定的茎环结构（3' SL），该茎环结构是RNA复制必需的[42]。在3'SL上游还有保守的环化序列（CS1或3'CS）。蜱 传 脑 炎 病 毒（Tick-borne encephalitis virus，TBEV）基因组可分为可变区和3'末端核心元件区[43]。在距3'末端有90～100个碱基序列可形成一个高度保守的结构元件，该结构是所有黄病毒科的典型特征。最近发现，TBEV的环化序列（5'-CS-A和3'-CSA）与以蚊为传播媒介的登革热病毒的CS元件并无相关性，二者在基因组中位置不同[44]，如TBEV的5'-CS-A位于5'NCR内AUG的上游，3'-CS-A则在3'SL的茎部；另一个不同点是TBEV的C蛋白编码区不是RNA复制所必需的。

EAV基因组和亚基因组负链RNA合成都是在3'末端起始的。经分析EAV 3'末端序列长200 nt，其中有两个结构域对于RNA合成十分重要[45]。第1个结构域在3' NCR上游（12 610～12 654 nt），内有一个小茎环（SL Ⅳ）；第2个结构域在3' NCR内部（12 661～12 690 nt）并折叠成一个大茎环结构（SLⅤ）。

PRRSV的ORF7位于3' NCR上游并含有一段34 nt的序列，是负链RNA合成必需的[46]。该序列高度保守并能形成一个茎环结构，在茎环的环结构上有一段7 nt长的序列能与3' NCR中的一个茎环结构发生相吻作用，对于病毒复制是必需的。

杯状病毒3' NCR长短不一。鼠诺如病毒（Murine norovirus，MNV）3' NCR中拥有保守的次级结构，类似的情况也出现在人类诺如病毒、水泡疹病毒和札幌病毒中。在MNV的3' NCR中有两个大茎环结构，其中一个末端发夹从7330 nt到末尾，另一个在7329 nt附近。通过对末端茎环突变后分析，发现这对RNA复制十分重要[47]。在FCV基因组3'末端也存在茎环结构，该结构位于3'NCR中并且靠近ORF3[48]。宿主细胞蛋白La、PTB和PAB均能与诺如病毒3'NCR-poly(A)中的顺式作用元件结合，但相应的生物学功能目前不明确。

3.2 3'NCR对病毒基因组翻译的调控 对于小RNA病毒， PABP在poly(A)的协助下通过结合IRES元件，从而达到增强翻译起始效率的目的[49]。PABP 的完整性和 poly(A)尾结构状态对于翻译的影响并不大[50]。研究发现，PV 3' NCR 能够激发IRES的活性，这样可以长时间维持病毒 RNA 5'NCR与 3'NCR末端的相互作用，从而使病毒在宿主细胞内具有持久的活性[51]。

3.3 3' NCR参与的RNA-RNA/protein相互作用FMDV 3' NCR 能够激发 IRES的活性，但是这种激发作用与病毒基因组 3'末端 poly（A）尾的结构及病毒蛋白酶（Lb）无任何关联[52]。也许是由于病毒基因组5'和 3'末端之间形成了稳定的 RNARNA 环化作用引起的，也有可能是病毒RNAProtein相互作用引起的，或者兼而有之。

最近有研究表明，FMDV的3'NCR中的每个茎环都能在体外与5'NCR的S片段相互作用，并且这种相互作用必须依赖于poly（A）尾存在的前提下才能起作用[53]。HAV 3' NCR中有一个假结体结构。GAPDH不仅能够与5' NCR相互作用，还能结合到3' NCR和基因组编码区3Dpol基因序列的上游[54]。EAV两种细胞蛋白（PTB和醛缩酶）能特异性的与3'NCR相互作用，但这种作用的生物学意义还不清楚。

4 结语

近年来，国内外学者对单股正链RNA病毒基因组的结构与功能进行了大量的研究，不仅有助于我们对此类病毒生命活动的了解，而且揭示了一些重要病毒的蛋白翻译、RNA复制以及病毒包装等过程的特征。如单股正链RNA病毒基因组中富含的RNA顺式作用元件，以及它们在病毒基因组复制以及增强病毒蛋白翻译起始等复杂过程中的作用等。这些发现对于人们了解RNA病毒的致病机理，并研发新型抗病毒药物或疫苗等都提供了重要理论依据。

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