肾细胞癌内皮抑素的表达与微血管密度相关性研究

李旭东 李桂玲 宋贯杰

实体肿瘤的增殖和转移依赖于新生血管的生成，受血管生成刺激因子和抑制因子的双重调节。内皮抑素(Endostatin)是一种内源性血管生成抑制因子，能特异抑制血管内皮细胞增殖和血管生成，肿瘤微血管密度(microvessel density，MVD)是衡量血管生成的定量指标，但MVD与RCC预后是否相关，以往文献报道的结果并不一致［1～3］。本研究检测RCC组织与癌旁组织Endostatin和MVD，并分析其与RCC病理类型、分级、临床分期之间的关系，以期为临床评估RCC提供客观预后指标，并为RCC的抗血管治疗提供研究依据。

1 资料与方法

1.1 一般资料 选择笔者所在医院2009年1月～2010年9月手术切除肾细胞癌组织标本且临床资料齐备者45例。男25例，女20例;年龄35～78岁，平均64.6岁。按WHO分级标准，G1 15例，G2 20 例，G3 10 例。采用 Robson分期［4］，Ⅰ期12例，Ⅱ期14例，Ⅲ期11例，Ⅳ期8例。经病理证实，透明细胞肾癌26例，嫌色细胞肾癌13例，嗜色细胞癌6例。另取肿瘤旁＞2 cm区域的正常肾组织35例作为正常对照组。病例纳入标准:(1)手术时未作放疗、化疗或其他针对肿瘤的生物治疗;(2)行根治性手术，术后病理证实为肾细胞癌，组织学分类明确;(3)术后石蜡标本保存完好，有足够待测组织。

1.2 实验方法

1.2.1 Endostatin检测 术后标本分别取肿瘤组织和肿瘤旁正常肾组织，脱水后石蜡包埋，连续切片，采用免疫组化SP法检测两组标本中Endostatin。Endostatin蛋白阳性表达为棕黄色颗粒，主要存在于细胞浆(即肿瘤细胞胞浆棕染)。记分标准参照许良中等［5］的方法，随机选根据细胞浆的着色程度及着色细胞的百分率进行评分。

1.2.2 MVD检测 采用weidner法［6］，用 CD34抗体标记微血管，计数肿瘤内着色的毛细血管和微小血管。凡呈现棕色单个内皮细胞或内皮细胞簇，均计为1个血管，但肌层较厚及管腔面积＞8个红细胞直径的血管不计数。先在低倍镜下(×100)浏览全体，取密度较大的“热点”处换高倍镜(×400)计数，取6个不同的视野范围，取平均值。

1.3 统计学处理 采用SPSS 13.0软件包对数据进行统计学处理。计量资料以(±s)表示，应用t检验，计数资料以率或百分比表示，多组均数间的比较应用单因素方差分析和χ2检验，相关性用双变量相关分析，以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 Endostatin的表达情况 Endostatin蛋白在癌旁正常肾脏组织中的表达率为31.4%，在肾癌组织为77.8%，在肾癌组织中的表达强度显著高于癌旁正常肾脏组织，差异有统计学意义(χ2=16.78，P＜0.01)。见表1。Endostatin蛋白表达在Ⅲ～Ⅳ期中阳性表达率高，与Ⅰ～Ⅱ期比较，差异有统计学意义(P＜0.01)。肾细胞癌患者年龄、性别、肿瘤大小、病理类型及病理分级比较差异无统计学意义(P＞0.05)。见表2。

表1 Endostatin在不同肾脏组织中的表达(n，%)

2.2 MVD的表达情况 肾癌组织中MVD水平明显高于癌旁正常肾脏组织，两者比较差异有统计学意义(t=7.291，P＜0.01)。见表3。临床分期Ⅲ～Ⅳ期MVD显著高于Ⅰ～Ⅱ期(P＜0.01)，临床分期越早，MVD越低，临床分期越晚，MVD越高;MVD在组织学G1、G2、G3级之间差异有统计学意义(P＜0.05)，组织学分级低，肿瘤分化好，MVD越低;组织分级升高，分化差，MVD升高。肾细胞癌患者年龄、性别、肿瘤大小比较差异无统计学意义。见表4。

2.3 Endostatin与MVD在肾癌组织中表达的相关性 Endostatin MVD在肾癌组织中表达的相互关系显示，Endostatin与MVD的表达具有相关性(P＜0.05)。见表5。

表3 MVD在不同肾脏组织中的表达

3 讨论

肾细胞癌(renal cell carcinoma，RCC)为富含血管的实体性肿瘤，肿瘤血管生成是血管形成促进因素和抑制因素之间失衡的结果，同时肿瘤血管生成也受进入循环系统的肿瘤细胞与肿瘤微环境的影响［7］。新生血管不仅可促进肿瘤的生长，还能为肿瘤提供足够的转移路径。一方面这些新生血管不成熟，结构缺乏完整性，管壁薄弱，比正常血管更容易被肿瘤细胞穿透，使瘤细胞易穿透血管顺血流到远隔部位形成微小转移灶［8］;另一方面肿瘤组织内基质不完善，使瘤细胞产生的各种因子和蛋白酶类渗漏至细胞间隙，进而诱发更多的血管生成。MVD作为恶性肿瘤的诊断、预后评估和分层治疗的客观指标而被广泛使用。本研究结果显示，RCC组织中MVD明显升高，且与病理分级和临床分期相关。表明新生的微血管使瘤体血供增加，即微血管为肿瘤的快速增长及代谢提供了物质基础。

Endostatin基因定位于Collagen XⅧ基因第38～43号外显子和部分37号外显子编码的C末端NC1结构域内［9］，在体内由胶原XⅧ降解产生，能通过多种途径抑制肿瘤血管的生成，阻断肿瘤的血液供应。国内外大量的文献报道表明，Endostatin能够有效控制非小细胞性肺癌、消化道肿瘤、脑胶质瘤等各类肿瘤的生长、浸润和转移［10～13］。本研究提示Endostatin蛋白在RCC组织中的表达水平显著高于癌旁正常肾脏组织，Endostatin的表达强度在不同临床分期的病例中，差异显著。Endostatin在正常组织中有一定表达，提示Endostatin参与了正常情况下血管形成的生理调节过程。本研究结果显示，RCC组织中MVD与内皮抑素呈高度相关，即随着MVD增加，Endostatin表达增强。这可能是由于RCC细胞为了满足其生长和浸润的需要产生了大量促血管生成因子，机体内的调节系统同时也会产生大量的Endostatin来抗衡机体内高水平的血管生成因子，这是机体的自身调节机制，但是这种代偿作用仍不能达到正常的平衡状态，最终因为调节失衡导致新生血管生成增多，促进了肿瘤的侵袭和转移。因此，测定 Endostatin、MVD可评估 RCC恶性程度、转移及预后。

表4 MVD在肾癌组织中表达与肾癌临床病理参数间的关系

表5 Endostatin与MVD在肾癌中表达的相互关系

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