毛细辛提取物体外抗氧化活性研究

何全磊，苗芳，李春玲

（西北农林科技大学生命学院，陕西 杨凌712100）

生物体内的自由基主要包括O2－·，·OH，以及H2O2等［1］，它们参与细胞调节和信号转导等活动［2］，但也会破坏体内的大分子如DNA，蛋白质和脂类［3］，同时还与衰老，癌症等疾病有关［4］，生物体内也有一系列的酶和小分子防御系统［5－7］，但在病理情况下，自由基的清除无效仍决定细胞尤其是细胞膜的损伤程度［8，9］。抗氧化物质可以通过一系列途径清除自由基［10］，因而显得尤其重要。人工合成的抗氧化剂如丁基羟基茴香醚（butyl hydroxy anisd，BHA）、2，6－二叔丁基－4－甲基苯酚（2，6－di－tert－butyl－4－methylp－henol，BHT）等有一定的副作用，因此寻找天然抗氧化物质成为研究的热点。

毛细辛（Asarum himalaicum）是马兜铃科（Aristolochiaceae）细辛属（Asarum）植物［11］，为传统中药，有发表散寒，镇咳，止痛，祛痰功效，还可以提取芳香油。

以往对于毛细辛的研究主要集中在挥发油部分，据罗文蓉和牛永红［12］报道，毛细辛中挥发油含量仅为0.5%，且挥发油成分中甲基丁香酚（methyleugenol）、榄香脂素（elemicin）、黄樟醚（safrole）为各种细辛所共有，其中以榄香脂素为最多。毛细辛挥发油成分的药理作用以镇静、镇痛、解热及局麻作用为主［13］，目前为止，未见关于毛细辛挥发油成分抗氧化功能的报道。对于非挥发油部分的成分及抗氧化能力研究报道也很少。谢百波等［14］利用溶剂提取、色谱技术等手段从毛细辛全草中提取鉴定了15个化合物，所有化合物均首次从毛细辛中分离得到，其中几个化合物有很强的抗氧化活性。

通过50%乙醇粗提和不同极性溶剂萃取的方法对毛细辛全草进行提取分离，采用多种抗氧化活性检测方法综合评价不同溶剂提取物的抗氧化能力，为毛细辛作为天然抗氧化剂的开发利用提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 样品的采集与制备 毛细辛全草于2010年6月采自秦岭南坡宁陕县境内的平和梁，自然阴干后粉碎成细末，装瓶备用。

实验的主要提取分离和抗氧化活性测定工作在2011年5－7月间完成，不同浓度提取物的处理均重复3次。

1.1.2 主 要 试 剂 2，6－二 叔 丁 基－4－甲 基 苯 酚 （2，6－di－tert－butyl－4－methylp－henol，BHT）、吩 嗪 硫 酸 甲 酯（phenazlne methosulfate）、邻二氮菲（1，10－phenanthrollne）从上海阿拉丁试剂有限公司购买；还原型辅酶I二钠（NADH I Na2）购自北京索莱宝科技有限公司；1，1－二苯基－2－苦苯肼自由基（1，1－diphenyl－2－plcrylhydrazyl radical，DPPH·）购自美国Sigma公司；氯化硝基四氮唑蓝（nitrotetrazolium blue chloride，NBT）购于国药集团化学试剂有限公司；其余试剂均为国产分析纯。

1.2 提取物制备

准确称取毛细辛粉末80g，置于索氏提取器中，以50%的乙醇、料液比为1∶12（g／mL）进行回流提取2h，提取3次，合并提取液，过滤，减压浓缩得到乙醇浸膏［15］。称量浸膏干重，然后将浸膏转入分液漏斗中，加200mL蒸馏水制成悬浮液。依次用等体积的石油醚、乙酸乙酯、正丁醇萃取，每级重复3次。最后得到石油醚、乙酸乙酯、正丁醇和水提取物。

1.3 提取物抗氧化活性的测定

分别将毛细辛4种溶剂提取物（石油醚提取物、乙酸乙酯提取物、正丁醇提取物和水提物）溶于体积分数为50%的乙醇中，配制成质量浓度为0.1，0.2，0.5，1.0，2.0，3.0，4.0mg／mL的溶液（具体浓度根据试验预试调整），同样也将BHT配制成以上对应浓度梯度的溶液。

DPPH· 清除能力测定参考Sarikurkcu等［16］的方法；·OH清除能力的测定参照 Wei等［17］的方法并稍作改动，将试验中用到的H2O2体积分数改为0.1%，邻二氮菲和FeSO4的浓度改为7.5mmol／L；O2－·清除能力的测定采用Ozsoy等［18］的方法，提取物对金属离子的螯合能力测定参照Gül9in和Berashvili［19］的方法。提取物对自由基的清除能力用清除率和IC50值表示。其中提取物对DPPH·、O2－·的清除和对金属离子的螯合均适用如下公式：清除率（或螯合率）＝［（A0－A1）／A0］×100%；其中，A0为阴性对照（用溶剂代替待测样品）在特定波长下的吸光度，A1为待测样品在特定波长下的吸光度；·OH的清除率公式为：清除率＝［（As－Ap）／（Ab－Ap）］×100%；其中，As为待测样品在536nm波长下的吸光度，Ap为用溶剂代替待测样品在536nm波长下的吸光度，Ab为用溶剂代替待测样品和H2O2时在536nm波长下的吸光度。

IC50值是清除率（或螯合率）为50%时的样品质量浓度。IC50值越大，表明该提取物清除自由基能力（或螯合金属离子能力）越弱，IC50值越小，表明该提取物清除自由基能力（或螯合金属离子能力）越强。

1.4 数据处理

所有测试重复3次，数据以“平均值±标准偏差（－x±s）”表示，采用Origin 8.5及Excel对数据进行分析。

2 结果与分析

2.1 毛细辛不同溶剂提取物清除DPPH·活性

DPPH·是一种非常稳定的合成自由基，可以从黄酮类化合物中吸收质子变成黄色，进而通过吸光值的变化反映样品对自由基的清除能力。黄酮类化合物的抗氧化活性与其清除DPPH·的能力呈正相关［20］。

毛细辛乙酸乙酯、正丁醇、水和石油醚提取物均具有清除DPPH·的能力（图1），4种提取物相比，乙酸乙酯和正丁醇提取物清除DPPH·的能力较强，而石油醚提取物清除DPPH·的能力最弱。乙酸乙酯、正丁醇、水和石油醚提取物清除DPPH·的IC50值分别为0.376，0.422，1.294和2 334.231mg／mL，均小于阳性对照BHT的IC50值（0.312mg／mL）。根据IC50值的大小，毛细辛4种溶剂提取物和对照BHT清除DPPH·的能力大小顺序为：BHT＞乙酸乙酯提取物＞正丁醇提取物＞水提取物＞石油醚提取物。

2.2 毛细辛不同溶剂提取物清除·OH活性

·OH是已知最强的氧化剂，几乎可以与所有细胞成分发生反应，对生物体危害极大［21］。通过Fenton反应体系产生·OH，进而可以测定各提取液对它的清除能力。

毛细辛4种溶剂提取物均具有清除·OH的能力（图2），且随着提取物浓度的升高，清除·OH的能力增强。毛细辛正丁醇、乙酸乙酯、石油醚和水提取物以及对照BHT的IC50值分别为0.776，0.781，2.082，4.325和0.266 mg／mL，依据IC50值的大小，毛细辛4种溶剂提取物和对照BHT清除·OH的能力大小顺序依次为：BHT＞正丁醇提取物＞乙酸乙酯提取物＞石油醚提取物＞水提取物。正丁醇和乙酸乙酯提取物清除·OH的能力比较接近，而水提取物对·OH的清除能力最弱。

2.3 毛细辛不同溶剂提取物清除O2－·的活性

超氧阴离子自由基（O2－·）是分子氧的单电子还原产物，极不稳定，具有高的反应活性，在食品、化工、医药等领域都受到广泛关注。本实验采用硝基四氮唑蓝还原法，通过检测吸光度的变化确定提取物清除O2－·的能力大小。

毛细辛乙酸乙酯、正丁醇、水和石油醚提取物均具有清除O2－·的能力（图3），并且清除能力与提取物浓度呈量效关系。毛细辛乙酸乙酯、正丁醇、水和石油醚提取物的IC50分别为0.297，0.365，0.988和3.965mg／mL，依据IC50值大小，毛细辛4种溶剂提取物清除O2－·的能力大小顺序为乙酸乙酯提取物＞正丁醇提取物＞水提取物＞石油醚提取物。毛细辛乙酸乙酯提取物清除O2－·的能力与对照BHT比较接近，它们的IC50值分别为0.297和0.296mg／mL。

图1 毛细辛不同溶剂提取物清除DPPH·的活性Fig.1 The DPPH·scavenging activity of different solvent extracts of A.himalaicum

图2 毛细辛不同溶剂提取物对·OH清除活性Fig.2 The hydroxyl free radical scavenging activity of different solvent extracts of A.himalaicum

2.4 毛细辛不同溶剂提取物对金属离子的螯合活性

很多金属离子在生物体内作为脂质过氧化反应催化酶的活性部位，对这些离子的螯合作用在一定程度上可以降低体内的脂质过氧化反应。因而提取物对金属离子的螯合能力从另一方面反映了它的抗氧化能力。

毛细辛4种溶剂提取物均对金属离子有螯合作用，而且水提取物具有较高的金属离子螯合能力，远远超过对照BHT对金属离子的螯合能力（图4）。毛细辛水、乙酸乙酯、正丁醇和石油醚提取物对金属离子螯合能力的IC50值分别为0.026，0.528，0.805和26.050mg／mL，BHT的IC50值为0.373mg／mL。依据IC50值的大小，毛细辛4种溶剂提取物和对照BHT对金属离子的螯合能力大小顺序依次为：水提取物＞BHT＞乙酸乙酯提取物＞正丁醇提取物＞石油醚提取物。

3 结论与讨论

黄酮类化合物是目前研究最多的一类抗氧化物，它们多具有酚羟基，易溶于水、甲醇、乙醇等极性强的溶剂，且多与糖类形成黄酮苷类物质。按照刘璐等［22］的方法，测得毛细辛提取物的总黄酮含量为6.43%。冯涛和庄海宁［23］研究表明：有游离3－OH 、5，7－间－二羟基，3’，4’－儿茶素（二羟基）、2－3双键、4－氧代基团的黄酮类化合物要比其相应没有这些结构特征的化合物的抗氧化活性强，糖苷类取代基会降低黄酮类化合物的抗氧化活性。谢百波等［14］从毛细辛中分离鉴定的15种化合物，其中（2S）－柚皮素－5，7－二－O－β－D－吡喃葡萄糖苷 （2S－naringenin 5，7－di－O－β－D－pyranosylglucoside）属于黄酮类化合物，该化合物有4’－OH 且5－和7－位被吡喃葡萄糖基取代，因而具有一定的抗氧化活性。据该文献报道，毛细辛乙酸乙酯部分含有6个马兜铃酸衍生物，4－羟基苯甲酸（4－hydroxybenzoic acid）、3，4－二 羟 基 苯 甲 酸 （3，4－dihydroxybenzoic acid）和 4－羟 基 肉 桂 酸 （4－hydroxycinnamic acid）。谭榀新等［24］研究表明：酚酸类物质中的羟基苯甲酸及其衍生物、羟基肉桂酸（羟基苯丙烯酸）及其衍生物均具有较强的抗氧化活性，其活性与酚羟基有关。毛细辛正丁醇部分所含的化合物是（2S）－柚皮素－5，7－二－O－β－D－吡喃葡萄糖苷，属于黄酮类物质，具有较强的抗氧化活性。本研究表明，毛细辛全草的乙酸乙酯提取物和正丁醇提取物均对DPPH自由基、羟基自由基和超氧阴离子自由基具有较强的清除能力，根据以上文献资料可以推断，毛细辛全草乙酸乙酯提取物的抗氧化活性与4－羟基苯甲酸、3，4－二羟基苯甲酸和4－羟基肉桂酸有关，而毛细辛全草正丁醇提取物的抗氧化活性与（2S）－柚皮素－5，7－二－O－β－D－吡喃葡萄糖苷有关。

图3 毛细辛不同溶剂提取物对O2－·的清除活性Fig.3 The superoxide anion free radical scavenging activity of different solvent extracts of A.himalaicum

图4 毛细辛不同溶剂提取物金属离子螯合能力Fig.4 The metal ion chelating power of different solvent extracts of A.himalaicum

毛细辛在陕西和甘肃等地作为药物细辛使用，国内外对其研究较少，但细辛属植物在含有的天然产物成分和化学性质方面都有很多的相似性。如谢百波等［14］的研究发现马兜铃内酰胺I（aristololactam I）和（2S）－柚皮素－5，7－二－O－β－D－吡喃葡萄糖苷在多种细辛属植物 （A.longerhizomatosum的根茎和根、A.maximum的根、A.ichangense以及A.canadense全草）中均有发现，故认为这两个成分很可能是该属植物的共有成分。

毛细辛及其他细辛属植物在挥发油组成和非挥发性成分上都很相似，所以它们的药理作用也很相似。通过分析国内外对其他细辛的研究就可以对毛细辛药用价值有所了解。

Dan等［25］的研究发现北细辛（A.heterotropoidesvar.mandshuricum）的挥发油对5种植物病原菌有光谱抗菌效果，尤其对恶疫霉（phytophthora cactorum）有最佳杀灭效果，挥发油中发挥生物活性的主要是甲基丁香酚（约占挥发油质量的59.42%）。毛细辛的挥发油含量约为北细辛的1／5［26］，且扈成浩等［27］的实验发现毛细辛挥发油主要成分与北细辛相近，而以榄香脂素为主，那么可以推知毛细辛挥发油对植物病原菌也应有抗菌效果，只是可能稍弱，具体的结果仍需要实验支持。

Cai等［28］的研究发现，毛细辛、青城细辛（A.splendens）和皱花细辛（A.crispulatum）95%的乙醇提取物或水提物对4种肿瘤细胞株（HL－60，BGC－823，KB和Bel－7402）中的一或两种有选择性的细胞毒活性，这为开发毛细辛的抗肿瘤药性提供了指导。

前文已提到毛细辛具有镇痛、解热等药理作用，但是其作用的机理尚不清除。Kim等［29］研究发现华细辛（A.sieboldii）的甲醇提取物通过激活类鸦片受体（opioid receptor）同时抑制血管缓激肽（bradykinin）和组胺调节的机体反应来发挥镇痛和抗发炎作用。毛细辛与华细辛同属，其镇痛和解热机理或许可以从中得到启示。

在抗氧化研究方面，Iwashinaa等［30］研究75种广义细辛属植物的黄酮组成，发现了3个查尔酮和1个橙酮。3个查尔酮为：柑橘酮－2’，4’－二－O－葡糖苷，柑橘酮－4，2’，4’－三－O－葡糖苷，柑橘酮－4－O－葡糖苷（chalcononaringe－nin 2，4’－di－O－glucoside，4，2’，4’－tri－Oglucoside，4－O－glucoside）；1个橙酮鉴定为金鱼草素－4，6－二－O－葡糖苷（aureisidin 4，6－di－O－glucoside）。此外，还发现一些黄酮醇类物质，它们是山奈酚－3，7－O－葡糖苷（kaempferol 3，7－O－glycoside），槲皮素（quercetin），异鼠李醇（isorhamnetin），黄酮，芹菜苷元－6，8－二－C－葡糖苷 （apigenin 6，8－di－C－glycoside），黄烷酮，柚苷－5，7－二－O－葡糖苷 （naringenin 5，7－di－O－glucoside），呫吨酮（xanthone）和芒果甙（mangiferin）。这些黄酮类物质都有一定的抗氧化活性。

毛细辛中含有 （2S）－柚皮素－5，7－二－O－β－D－吡喃葡萄糖苷，Lin和 Chiou［31］的研究显示柚皮素对人视网膜色素上皮细胞 （ARPE219）和人脐静脉内皮细胞 （HUVEC）有抗氧化作用，当上述细胞面临缺氧或者受到NaN3和H2O2氧化胁迫时，一定浓度的柚皮素能提高细胞的生存率，同时对这两种细胞均有抗氧化作用。那么，毛细辛提取物能否通过发挥其抗氧化活性来治疗老年视网膜黄斑变性将是一个令人期待的问题。

尽管毛细辛及其他细辛属植物在医药方面的巨大价值和潜能，但是在实际用药过程中，仍然不得不面对一个头疼的问题：它们的毒性。Schaneberg和Khan［32］的研究发现：细辛属植物具有肾毒性并可能致命的原因是它们都含有马兜铃酸 （aristolochic acid）I和II。因而，将毛细辛提取物用于抗氧化剂或其他药用时，一定要充分考虑安全问题。

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