转基因苜蓿对土壤微生物的影响

燕丽萍，刘翠兰，李丽，李双云，杨庆山，孙超，梁慧敏，张颖，张兆云，夏阳＊

（1.山东省林业科学研究院，山东 济南250014；2.山东省林木遗传改良重点实验室，山东 济南250014；3.江苏农林职业技术学院，江苏 句容212400；4.山东省海阳市林业局，山东 海阳265100）

苜蓿（Medicago sativa）被誉为“牧草之王”，是优良的经济生态植物，但现有的苜蓿品种，无论国内培育还是国外引进，抗旱、耐盐能力仍然有限［1，2］。传统的苜蓿抗逆育种由于受种内抗逆基因资源的限制［3］，育种难度不断增大。利用转基因技术将抗逆基因导入苜蓿基因组中，是培育耐盐抗旱苜蓿新品种的有效方法。本课题组培育的耐盐抗旱转BADH基因苜蓿新品种，推动饲草产业化发展、提升养殖业发展水平、带动区域经济快速发展、促进农民增收具有重要的经济作用；特别是提高黄河三角洲和内陆盐碱干旱地区植被恢复，缓解生态恶化等方面具有重要的生态和社会意义。

然而，随着转基因技术的飞速发展以及转基因植物的大面积种植，在关注转基因植物所带来的巨大社会、经济和生态效益的同时，转基因植物的安全性问题也引起了世界范围内的广泛关注。目前，转基因植物风险评价主要集中在转基因植物与近缘物种的基因流［4］、目标害虫的抗性［5］以及对非目标动植物的多样性和生态系统［6］的影响，在其是否会导致严重的生态环境问题方面存在分歧。近年来，转基因植物对土壤生态环境、土壤微生物群落结构和多样性的影响是转基因植物生态评价中一个很重要的内容，已成为一个研究热点。

土壤是农业生产中物质转化与能量交换的重要场所，在农业生态系统中居核心地位，土壤微生物是土壤生态系统的重要组成部分［7，8］。因此开展转基因植物对土壤微生物影响方面的研究对科学评价转基因植物安全性潜在的生态风险具有重要地位和生态学意义。为探讨转基因植株对土壤微生物种类和数量变化的影响程度，本研究以实验室成功获得转BADH基因苜蓿［9－12］，并于2008年获得国家林业局“转BADH基因苜蓿”环境释放和生产试验行政许可证进入田间试验阶段的转基因苜蓿和非转基因亲本苜蓿对照（中苜1号）为材料，连续2年对其根圈土壤微生物种类和数量进行监测，评估其潜在生物安全风险，以期为建立转基因植物对土壤生态风险评价体系提供参考。

1 材料与方法

1.1 供试材料

供试材料为转BADH基因紫花苜蓿，对照为常规紫花苜蓿“中苜1号”。

1.2 试验地

大田试验在山东省林业科学研究院东营分院实验基地进行。实验地的土壤类型包括潮土和盐化潮土，其土壤盐分以NaCl为主，土壤为潮土和盐土，其含盐量介于3‰～5‰。

1.3 试验设计

转基因苜蓿和对照中苜1号，采用完全随机区组设计，每品种重复3次，小区面积为32m2（8m×4m），试验地四周设1.5m保护行。2006年8月24日播种，条播，行距50cm，播深1～2cm，播种量为7.5kg／hm2，管理比较粗放，种植当年灌水1次。

1.4 土壤取样和微生物培养

分别在2008和2009年的7，8，9月以东营转基因苜蓿和对照试验地作为土壤采样地。利用3点混合采样法采集0～20cm的土壤，保鲜带回实验室。每份土壤样本各称10g放于90mL无菌水中，振荡30min后，依次稀释为不同浓度的稀释液。分别取100μL，涂布不同培养基平板，细菌采用牛肉膏蛋白胨麦芽汁琼脂培养基，真菌采用马丁氏孟加拉红琼脂培养基计数，放线菌采用淀粉铵盐琼脂培养基，每一处理重复3次，保温培养。细菌37℃、培养2～3d，真菌25℃培养5～7d，放线菌28℃培养7～10d，记录菌落数在30～300内的平板菌落数。根据下式计算：土壤微生物数量（个／g）＝菌落平均数×稀释倍数／土壤重量（g）［13］。

1.5 土壤总DNA的提取

1.5.1 DNA的提取 土壤总DNA的提取采用Omega公司的Soil DNA Kit试剂盒，分别称取混合好的土样0.5g，按照操作说明书进行提取，制备好的DNA置于－20℃保存备用。

1.5.2 微生物菌株的DNA提取 细菌、真菌和放线菌基因组DNA的提取参考魏冰等［14］的方法提取。

1.6 土壤总DNA的PCR扩增反应

以土壤总DNA和菌株DNA为模板，质粒DNA为阳性对照，双蒸水（ddH2O）为阴性对照。根据BADH序列设计特异引物（F：5’－AGA ATG GCG TTC CCA ATT CCT GCT C－3’；R：5’－TTC AAG GAG ACT TGT ACC ATC CCC A－3’，由上海生工生物工程公司合成）进行PCR扩增，扩增片段的大小为1.5kb。PCR反应体系总体积为25μL，2×Taq PCR MasterMix 12.5μL （天根生化科技有限公司），F （10μmol／L）1μL，R （10 μmol／L）1μL，ddH2O 10.5μL。扩增反应条件为：94℃预变性5min，94℃变性30s，55℃退火45s，72℃1.5 min，循环30次，72℃延伸10min。电泳Marker为TAKARA公司生产的DL15000，扩增后用1%的琼脂糖凝胶电泳，EB染色后在紫外灯下观察拍照。

1.7 统计分析

本实验测定的数据均为3次重复的平均值，所有数据用SPPS 13.0统计软件进行分析，平均数用LSD法进行比较。

2 结果与分析

2.1 转基因苜蓿地土壤微生物的变化

分别对转基因苜蓿地和非转基因苜蓿地土壤微生物进行分类统计，计算平均数（表1）。通过连续2年6个月的数据显示，转基因苜蓿地和未转基因苜蓿地土壤中微生物细菌、放线菌和真菌的数量变化趋势一致，表现为8月微生物数量达到高峰，9月份下降，总体上7，8，9月份细菌、真菌和放线菌数量呈先升后降的趋势。2年间土壤微生物细菌均占优势，其次为放线菌，真菌数量最少，这种现象与自然条件下土壤微生物数量的分布比例一致。尽管不同年份这2个苜蓿品种种植地细菌、放线菌和真菌的数量有变化，2009年细菌和真菌数量比上一年下降，放线菌数量比上一年增加，但是微生物数量变化趋势一致，没有发生某一类微生物数量骤增或骤减的现象。表明转基因植株没有破坏主要微生物种类之间的平衡。

2.2 苜蓿地间土壤微生物的比较

分别对2年生转基因苜蓿地和3年生转基因苜蓿地在6个月内的3种土壤微生物数量进行单因素方差分析与多重比较（表2）。结果表明，转基因植株地与非转基因植株地之间的细菌数量、放线菌和真菌数量无差异显著。说明该试验地转BADH 基因苜蓿的外源基因在调查的2年内尚未对种植地内的土壤微生物种类和数量造成显著影响。

表1 不同年份不同月份土壤微生物数量Table 1 Populations of microorganism in the soil of the different months in the different years 个 No.／g

2.3 2年间土壤微生物数量对比

对2008和2009年不同年份同一月份的土壤3种微生物数量进行单因素方差分析和多重比较（表3）。结果表明，土壤细菌数量所有月份年份间的差异均不显著（P＞0.05）。土壤真菌数量在7月份的差异达到显著水平（P＜0.05），而其余月份均无显著差异。土壤放线菌数量在所有月份年份间差异均不显著（P＞0.05）。由此可见，不同种植年限的转基因苜蓿土壤细菌数量、放线菌数量和真菌数量差异未达显著水平，个别月份年份间虽有差异，推测可能为自然条件的差异所致，说明转基因苜蓿种植年限的增加并未对土壤微生物生态安全造成影响。

2.4 外源基因水平转移到根系土壤微生物可能性分析

以试验地内土壤微生物基因组DNA混合样品和菌株DNA为模板、利用目的基因BADH基因特异性引物进行PCR反应，所得结果见图1。阳性质粒对照进行的PCR反应有目的条带的产生，而所有土壤微生物DNA样品、各类培养菌株DNA和无模板水对照样品均未检测到目的基因PCR扩增产物（图1），表明本试验地内转基因苜蓿的目的基因BADH尚未水平转移到土壤微生物中。

表2 株系间土壤微生物单因素方差分析Table 2 ANOVA results of microorganism in the soil of different lines

表3 不同年份相同月份土壤微生物单因素方差分析Table 3 ANOVA results of microorganism in the soil of the same months in the different years

3 讨论

转基因植物自商业化种植以来，其对环境的影响备受关注和争议，转基因植物对土壤生物可能造成的影响一直是人们进行转基因植物安全性评价的焦点，转基因植物对土壤生态系统的影响列为风险评价的重要组成部分。转基因植物外源基因表达产物经根系分泌后进入土壤生态系统从而影响土壤微生物群落，使土壤的特异生物功能类群以及土壤生物多样性都有可能因此改变。一些研究表明，种植转基因植物对土壤微生物产生了明显的影响。沈法富等［15］发现在棉花（Gossypium hirsutum）发育的花铃期和吐絮期，Bt棉根际细菌生理群的总数量比常规棉增加，但是根际细菌生理群的Simpson指数、Shannon－Wiener指数和细菌生理群分布的均匀度下降。刘佳等［16］研究了抗草甘膦转基因大豆（Glycine max）不同程度上降低了根际土壤微生物的数量和生化强度，并对根际土壤真菌生长有一定的促进作用。Dunfield和Germida［17］研究了在加拿大的4个不同田块连续2年种植4种转抗除草剂基因的油菜（Brassica campestris）和4种常规油菜品种对根际微生物多样性的影响。转基因油菜的根际微生物群落在一些脂肪酸上显著偏高，表明其微生物群落组成发生了变化。

图1 BADH基因在土壤微生物基因组DNA中的PCR扩增Fig.1 PCR amplification of BADHgene in genomic DNA of soil microorganism

但多数研究结果表明，转基因植物对土壤生物影响较小，周琳等［18］研究结果表明，几丁质酶和核糖体失活蛋白双价基因的导入并没有对大豆根际可培养细菌（含芽胞杆菌和产荧光假单胞）、真菌和放线菌的数量以及细菌和真菌的群落结构产生显著影响。Donegan等［19，20］在研究转基因Bt棉花和转基因马铃薯（Solanum tuberosum）的根系分泌物对土壤中细菌的影响时，发现根系细菌数量短期内在转基因植物与对照组之间并无明显差异。Schmalenberger和Tebbe［21］等在研究转基因玉米（Zea mays）、转基因欧洲黑杨、转基因银腺杂种杨和转基因毛白杨杂种［14，21－23］等转基因植物对根部土壤微生物也没有显著影响。本研究通过对转基因草地与非转基因草地土壤微生物数量连续2年的调查分析，结果证明转基因苜蓿尚未对土壤微生物数量造成影响。对不同年份同一月份的土壤微生物数量进行均值比较与单因素方差分析，结果发现3种微生物数量无显著差异，初步说明转基因苜蓿种植年限的增加并未对土壤微生物系统造成影响。

另外，由于不可培养的微生物占据微生物总数的90%以上［24］，传统的平板培养方法的局限性，不能对土壤中的微生物进行全面、系统的分析。本试验通过提取土壤中群体微生物总DNA和提取单个菌株DNA的方法，从分子生态学角度检测了外源基因在土壤微生物中是否发生了基因水平转移。在菌株DNA和土壤总DNA中都没有发现外源基因，充分证明了导入的外源基因没有引起土壤微生物群落数量和群落组成结构的变化，尚未水平转移到土壤微生物中，该遗传操作是安全的。

综上所述，本试验结合传统的平板培养法和不依赖于培养的PCR技术，在多个月份对土壤细菌、真菌、放线菌的数量进行了连续2年的监测，获得大量相关数据，进行了全面系统的研究。结果表明，BADH外源基因的导入，并没有引起土壤微生物的数量和群落结构的显著变化，说明外源基因的转入对于土壤微生物的环境是安全的。本研究初步为该转基因抗盐碱苜蓿的商业化种植提供了科学依据和理论基础，也为其他转基因植物土壤微生物安全性研究提供了可靠的参考。然而，转基因植物安全性监测是一个重要的、长期而复杂的过程，因此对转BADH基因苜蓿生态安全性的了解需要长期的跟踪、深入、系统的调查，未来的长期影响尚待进一步研究。

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