复方骨肽注射细菌内毒素的检查方法研究

冯 磊

中国食品药品检定研究院，北京 100050

骨肽及复方骨肽注射液均具有刺激成骨细胞增殖、调节骨代谢、促进新骨形成等多种药理作用，复方骨肽注射液是在骨肽注射液的基础上，采用现代生物工程技术，与全蝎提取液制成的复方肽类制剂，含有多种骨生长因子，具有消炎止痛，促进骨愈合、生长等作用。临床多用于骨折和骨科手术愈合及风湿、类风湿性关节炎、原发性骨质疏松等疾病的治疗等[1-3]。本品现有的质量标准的控制采用热原检查法，本研究确定了复方骨肽注射液的内毒素检查限值并研究其使用细菌内毒素检查法的可行性，为其质量标准提高提供依据。

1 资料与方法

1.1 仪器与试剂

细菌内毒素测定仪，型号BET-72（天津市天大天发科技有限公司）；鲎试剂（TAL，厦门鲎试剂实验厂有限公司，批号:100420，规格1.7 mL/支，湛江安度斯生物有限公司，批号 :1010142，检测范围 =10.00 ～ 0.03 EU/mL，1.25 mL/支）；细菌内毒素检查用水（BET水，中国食品药品检定研究院，内毒素含量＜0.005 EU/mL，规格:10 mL/支）；细菌内毒素国家标准品（NSE，中国食品药品检定研究院，批号:150600-200707，10 000 EU/支）；复方骨肽注射液（常州方圆制药有限公司，规格：5 mL∶ 75 mg，批号：20110219A，20110219B，规格：2 mL∶30 mg，20110313A，20110104A；南京新百药业有限公司，规格：5 mL∶75 mg，批号：110301，110302，规格：2 mL∶30 mg，批号：110105，110301。其他材料：漩涡振荡器（scientific industries），试管，移液管，试管架。试管等玻璃器皿严格按照《中国药典》2005年版二部附录“细菌内毒素检查法”中的相关要求经过浸泡、冲洗、干烤除细菌内毒素[4]。

1.2 方法

1.2.1 供试品细菌内毒素限值（L）的确定 根据公式：L=K/M，其中M为人用每公斤体重每小时最大剂量，依据药品使用说明书，10 mL溶于生理盐水后静脉滴注，则M为10 mL/h；K为按规定的给药途径，临床无任何不良反应的内毒素阈剂量，即人用每公斤体重每小时可最大接受的内毒素剂量，一般注射剂为5 EU/（kg·h），中国人平均体重按60 kg计。故中国人的内毒素阈计量为300 EU/h，由于该药需要溶解在生理盐水内静脉滴注，计算时应考虑生理盐水所占的内毒素量，生理盐水的内毒素限值为0.5 EU/mL，滴注速度一般不超过250 mL/h，代入公式计算复方骨肽注射内毒素限值。

1.2.2 标准曲线的可靠性试验 标准曲线系列溶液的制备：用细菌内毒素检查用水将内毒素国家标准品进行10 ～ 2倍稀释，最终细菌内毒素浓度分别为 1.0、0.5、0.25、0.125、0.062 5、0.031 25 EU/mL稀释系列，即λ=0.031 25 EU/mL。阴性对照：使用的内毒素检查用水即为阴性对照液。各取0.1mL分别加到预先加有0.1 mLTAL试剂反应管内，混合均匀，立即插入BET-72细菌内毒素测定仪内进行自动检测，其中每一个浓度重复3管，每个批号的鲎试剂进行一次可靠性试验。

1.2.3 样品最大有效稀释倍数（MVD）计算[1]公式为：MVD=L·C·λ-1。L为复方骨肽注射液内毒素限值，即L=17.5 EU/mL；C为1.0 mL/mL；λ为标准曲线的最低内毒素浓度0.031 25 EU/mL；计算得复方骨肽注射液MVD。

1.2.4 干扰试验预实验 样品系列溶液的制备：复方骨肽注射液用内毒素检查用水依次稀释为 35、70、140、280、560倍溶液，记为Ai液。样品阳性对照溶液制备：将复方骨肽注射液用内毒素检查用水依次稀释为含有标准内毒素λm=0.1 EU/mL的35、70、140、280、560倍样品溶液，作为样品添加内毒素阳性对照管，记为Bi液。标准曲线系列溶液的制备：用细菌内毒素检查用水将内毒素国家标准品进行10 ～ 2倍稀释，最终细菌内毒素浓度分别为 1.0、0.5、0.25、0.125、0.062 5、0.031 25 EU/mL 稀释系列，即λ=0.031 25 EU/mL记为C液。阴性对照：使用的内毒素检查用水即为阴性对照液，记为D液。分别取上述各液0.1 mL，加入预先加有0.1 mL TAL试剂的反应管内，混匀立即插入BET-72细菌内毒素测定仪内进行检测，其中每一个浓度重复2管，用C液结果进行线性拟合，计算回收率。回收率（%）=（Bi液内毒素值-Ai液内毒素值）×λm×100%。每个生产厂家选取一批，并用每个批号的鲎试剂进行一次干扰试验。

1.2.5 干扰试验 选取70倍稀释进行干扰试验。样品系列溶液的制备：复方骨肽注射液用内毒素检查用水依次稀释为70倍溶液，记为Ai液。样品阳性对照溶液制备：将复方骨肽注射液用内毒素检查用水依次稀释为含有标准内毒素λm=0.1 EU/mL的70倍样品溶液，作为样品添加内毒素阳性对照管，记为Bi液。标准曲线系列溶液的制备：用细菌内毒素检查用水将内毒素国家标准品进行10 ～ 2倍稀释，最终细菌内毒素浓度分别为 1.0、0.5、0.25、0.125、0.062 5 EU/mL 稀释系列，即λ=0.031 25 EU/mL记为C液。阴性对照：使用的内毒素检查用水即为阴性对照液，记为D液。分别取上述各液 0.1 mL，加入预先加有0.1 mLTAL试剂的反应管内，混匀立即插入BET-72细菌内毒素测定仪内进行检测，其中每一个浓度重复2管，用C液结果进行线性拟合，计算回收率。

2 结果

2.1 复方骨肽注射的限值

经过计算确定为17.5 EU/mL。

2.2 标准曲线的可靠性试验

标准曲线的可靠性试验符合规定。见表1。

表1 标准曲线的可靠性实验结果（n=3）

2.3 液最大有效稀释倍数（MVD）

计算结果为560倍。

2.4 干扰试验预试验

标准曲线:安度斯鲎试剂批号1010142，lgT=3.008 78–0.360 42 lgC，r=-0.994 0。阴性对照结果符合规定。厦门鲎试剂批号 100420，lgT=2.778 62–0.291 52lgC，r=-0.997 0。阴性对照结果符合规定。

样品的添加内毒素平均回收率均在50%～200%范围内，符合《中国药典》2010年版规定，初步表明样品的5个浓度溶液均对内毒素与鲎试剂的反应无干扰影响。见表2。

表2 方骨肽注射液的干扰试验预实验回收率试验结果（%，n=2）

2.5 干扰试验

标准曲线:安度斯鲎试剂批号1010142，lgT=3.02120–0.312 56 lgC，r=-0.99 22。阴性对照结果符合规定。厦门鲎试剂批号 100420，lgT=2.671 20–0.296 47 lgC，r=-0.998 5。阴性对照结果符合规定。两个生产厂家的8批复方骨肽注射液的回收率均在50%～200%范围内。见表3。

表3 复方骨肽注射液的干扰试验预实验回收率试验结果（n=2）

2.6 结论

复方骨肽注射液在该实验条件下对2个厂家的鲎试剂不存在干扰作用，该品种可以使用动态浊度法进行细菌内毒素测定。

3 讨论

细菌内毒素检查法与用传统的家兔法检测热原物质相比，操作简单，影响因素少，不使用动物试验，更符合3R（减少、优化、替代）的动物福利原则。并且不需建立动物房即可进行实验，对细菌内毒素的灵敏度大大高于家兔法且具有非常好的重复性。在世界各国药典中内毒素检查法已成为热原物质检查的重要方法。复方骨肽注射液关于内毒素检查法的干扰试验结果表明，复方骨肽注射液对内毒素和鲎试剂的反应不存在干扰作用，可以用于日常检验和质量控制。本实验的8批次复方骨肽注射液内毒素含量均小于4.375 EU/mL。低于限值17.5 EU/mL内毒素含量符合规定。

细菌内毒素检查法分为凝胶法和光度测定法两大类共计6种检查法，实际检验时，除另有规定外，可使用任意一种方法进行检测。凝胶法为限量和半定量检查，而光度测定法为定量测定。在我国目前应用最为广泛的是凝胶法，但凝胶法由于其本身为定性试验，不能直观量化回收率，因此干扰试验操作复杂，人工成本和材料成本都较高，并且无法对与鲎试剂反应产生阳性的样品进行干扰试验的研究，具有很大的局限性。因此本研究采取了在我国光度测定法中应用最为广泛的动态浊度法，其在干扰试验方面更为科学和准确。而通过本实验确定了复方骨肽注射液可以应用于动态浊度法，由于浊度法与凝胶法拥有相同的反应机制，都是通过内毒素与鲎试剂中的酶反应产生凝聚同时发生浊度变化，所以本实验的结论对于凝胶检查法的适用性仍有参考价值。通过本研究验证了动态浊度法在品种建立、家兔热原检查法转换细菌内毒素检查法中的突出优越性。

[1]段景柱，崔少千.复方骨肽注射液促进四肢骨折愈合的临床观察[J].实用药物与临床，2006，9（3）：169-170.

[2]赵刚，张士坤.应用复方骨肽注射液治疗原发性骨质疏松症的临床观察[J].中国医院药学杂志，2009，29（6）：478-479.

[3]邓利娟，任雪，范慧红.骨肽及复方骨肽注射液降压物质的研究[J].中国生化药物杂志，2010，31（4）:231-232.

[4]国家药典委员会.中国药典（2010年版）.第3部.北京：中国医药科技出版社，附录XIIE，附录95-98.