冰结构蛋白及其应用研究

樊凯凯，刘爱国，*，陈东，曾国江，王弘，冯秀月

（1.天津市食品生物技术重点实验室，天津商业大学生物技术与食品科学学院，天津300134；2.天津市大桥道食品有限公司，天津 300350）

冰结构蛋白（Ice Structuring Proteins，ISP）又称为抗冻蛋白（anti-freeze proteins）或热滞蛋白(thermal hysteresis proteins），它们是一组能阻止冰结晶形成，控制其生长，改变冰冻或自然生长过程中冰核与冰晶体的生长规律、生长速度、冰晶体形状和大小，并能抑制重结晶的天然蛋白质。它们可以非依数性降低溶液的冰点，而对熔点的影响很小，从而使溶液的冰点和熔点之间出现一差值，该差值称为热滞活性（thermal hysteresis activity，THA）。ISP存在于动物（如昆虫和鱼类）、植物（如胡萝卜、冬麦草、桃树等）、细菌以及真菌中，可以在低温下保护生物机体免受冷冻的损伤。

1 冰结构蛋白的分类

从20世纪70年代首次从鱼类的血液中提取出冰结构蛋白以来，经过几十年的研究发展，人们相继从植物，昆虫，细菌，真菌中发现了具有同样功能的蛋白质，它们在组成和结构上各不相同，并在基因序列上也没有同源性，从而造就了冰结构蛋白的多样性和复杂性。

1.1 鱼类中冰结构蛋白的分类

鱼类中冰结构蛋白主要分为6大类，分别是ISGP（Ice Structuring GlycoProtein）、ISPⅠ、ISPⅡ、ISPⅢ、ISPⅣ、Hyperactive-ISP。

1.1.1 ISGP

ISGP是从南极Trematomus borchgrevinki血清中分离得到的，由[-Ala-Ala-Thr-双糖单位-]以不同的重复度串联形成的多聚物，其中双糖是葡萄糖-N-乙酰半乳糖。其分子量在2.6 ku～33.7 ku之间。分子量越大活性越高。糖基是其起作用的主要集团[1]。通过对糖基进行乙酰化或过氧化等化学修饰后，其活性丧失，并有报道称其结构是一种与多聚脯氨酸Ⅱ相似的左手螺旋，并且其双糖疏水基团面向碳骨架，而亲水基团面向溶液[2]，以此结构来发挥活性。

1.1.2 ISPⅠ

ISPⅠ是从冬季比目鱼和杜父鱼中纯化出来的一种蛋白质，它的分子量一般在3.3 ku～4.5 ku之间，是11个[-Thr-X2-Asx-X7-]氨基酸残基的重复单元，其中X一般代表Ala，在ISPⅠ中Ala的含量高达60%。ISPⅠ的二级结构都是α-螺旋，三级结构为单一的α-螺旋[3]形成的球状结构。冬季比目鱼和杜父鱼产生的ISPⅠ还包括两个亚型：肝脏型ISPⅠ（liver-type winter flounderISPⅠ）和皮肤型ISPⅠ（skin-type winter flounder ISPⅠ）。肝脏型ISPⅠ是由肝脏细胞分泌的，因其含信号肽，所以可以分泌到血液中，发挥作用；而皮肤型ISPⅠ是由皮肤等与环境直接接触的组织细胞分泌的，不含信号肽。因此，只能在细胞内发挥作用，并且肝脏型ISPⅠ的活性是皮肤型ISPⅠ的2倍。

1.1.3 ISPⅡ

ISPⅡ首先是从太平洋鲱鱼（Clupea pallas）血清中发现的，随后又在日本胡瓜鱼以及海渡鸦中发现，它的分子量在11 ku～24 ku之间，是鱼类ISP中分子量最大的一类[4]。它的一级结构的氨基酸排列中富含半胱氨酸，因此二硫键居多。二级结构中包含2个α-螺旋，2个β-折叠，并含大量的无规则卷曲。三级结构为球状蛋白。ISPⅡ是唯一一种与已知蛋白质（凝集素C）有同源性的ISP[5]。太平洋鲱鱼和日本胡瓜鱼中的ISPⅡ的冰结合位点与凝集素C的糖结合位点同源，其活性和稳定性需要Ca2+存在，而海渡鸦中的ISPⅡ的冰结合活性与Ca2+无关。

1.1.4 ISPⅢ

ISPⅢ是从Zoarcoid科的鱼类（Ocean Pout美洲大绵鳚）中分离出来的。它的分子量在6.5 ku～14 ku之间。它的一级结构中既不富含丙氨酸也不富含半胱氨酸，二级结构主要有9个β-折叠组成，其中8个组成了三明治夹心结构，另外1个游离在外。在这种三明治夹心结构中，3个串联的β-折叠以“川”字排列，与另外3个串联的β-折叠反向平行，剩余的2个则反向平行的分布于在“川”字外侧[5]。三级结构是由9个β折叠相互作用形成的球状蛋白。

1.1.5 ISPⅣ

ISPⅣ是从多刺床杜父鱼（Myoxocephalus octode-cemspinosus）中分离出的一种ISP。其分子量大约为12.3 ku。一级结构包含108个氨基酸，N端连接了一个焦谷氨酰基团，其中谷氨酸含量可达17%。二级结构主要为4个α-螺旋。三级结构是由4个α-螺旋反向平行排列而成的螺旋束，疏水基向内、亲水基向外发挥作用。ISPⅣ结构与膜载脂蛋白具有部分同源性[6]。

1.1.6 Hyperactive-ISP

Hyperactive-ISP是从冬季比目鱼中发现的除ISPⅠ外的另一种冰结构蛋白。其分子量远远大于ISPⅠ，并且活性也高于ISPⅠ，它可以使冬季比目鱼在-1.9℃下生存，而ISPⅠ只能使冰点降到-1.5℃[7]。冬季比目鱼生活的极地海洋和北温带沿岸水域的冬季温度一般在-1.9℃，因此，可以说是Hyperactive-ISP真正赋予冬季比目鱼在-1.9℃的水域下生活的能力。

1.2 昆虫中冰结构蛋白的分类

目前研究最多的昆虫ISP基本都是从黄粉虫（Tenebrio Molitor）、毛虫（Dendroides Canadensis）、枞色卷蛾（Choristoneura Fumiferana）、美洲脊胸长椿（Oncopeitus Fasciatus）等4种昆虫中分离纯化的。昆虫ISP是目前已知热滞活性最高的ISP，可达5℃～10℃。

黄粉虫ISP（Tenebrio Molitor ISP）的分子量为8.4ku，一级结构主要是由12个氨基酸（CTXSXXCXXAXT）的重复单元组成，富含苏氨酸、半胱氨酸。二级结构主要是β-片层，三级结构在8个二硫键作用下形成7个螺周的右手β-螺旋结构。黄粉虫ISP在毫摩尔浓度下的热滞活性是鱼类的10倍～100倍[8]。ISP可降低黄粉虫血淋巴的冰点至-5℃，若与高浓度的甘油一起作用可降低冰点至-14℃。

毛虫 ISP（Dendroides Canadensis ISP）包含 DISP-1、DISP-2两种亚类，其相对分子质量约为8.7 kDa，分别含有83、84个氨基酸残基。一级结构是7个含12或13个氨基酸残基（CTXSXXCXXAXTX）的重复序列，含半胱氨酸15.9%。二级结构是46%β-折叠、39%β-转角、2%螺旋、13%无规则卷曲。三级结构是由16个半胱氨酸形成八对二硫键的相互作用而形成。用DTT（二硫苏糖醇）处理毛虫ISP，可破坏某些二硫键，从而使其失去生物活性。也正是由于二硫键的存在，赋予其耐受100℃高温的特性[9]。

枞色卷蛾 ISP（Choristoneura Fumiferana ISP）包含多种同型冰结构蛋白。其分子量在9.0 kDa左右，其结构是左手β-螺旋，每螺周的结构是包含15个氨基酸残基形成的三角形结构，三角形的边是β-折叠，其中Thr-X-Thr重复出现，富含苏氨酸和半胱氨酸。枞色卷蛾ISP的抗冻活性是鱼类ISP的3～4倍。枞色卷蛾ISP同型冰结构蛋白中的CFISP-501比其他枞色卷蛾ISP多出30或31个氨基酸残基，即多出两个螺周，而形成两个额外环，有报道称正是由于多出的两个环，其与冰晶的结合更加严密，而使其抗冻活性是鱼类ISP的10倍～100倍。

1.3 植物中冰结构蛋白的分类

植物中冰结构蛋白的研究比较晚，但是其来源广泛易得，如胡萝卜，女真叶，冬小麦等都可提取冰结构蛋白，并且植物性的冰结构蛋白在应用中也容易为人们所接受，因此对植物性冰结构蛋白的研究越来越多，如江南大学的黄卫宁等主要就是研究植物性冰结构蛋白的提取以及在冷冻面食中的应用。植物的冰结构蛋白的抗冻活性不高，热滞活性略低于极地鱼类的冰结构蛋白活性。

胡萝卜ISP包含322个氨基酸残基，分子量为36.8 ku。一级结构富含亮氨酸，N端带有糖基化。二级结构包含24个氨基酸形成的两个β-折叠和一个螺旋，从而形成了三级结构的有规律的右手β-螺旋的糖蛋白。pI=5.0，其热滞活性为0.35℃。用相应酶切除糖链分子不影响重结晶抑制活性，从而表明糖链不是其主要的活性部位。

黑麦草（Olium perenn）ISP是由118个氨基酸残基相互作用形成的，分子量为13 ku。一级结构由14或15个氨基酸重复单元组成。二级结构是重复序列组成的一个环，总共8个环。三级结构是8个环形成的β-筒状结构，一端是缬氨酸组成的疏水区域，另一端是天冬酰胺组成的亲水的区域。糖基化或去糖基化不影响黑麦草ISP与冰晶的结合，也就是说不影响黑麦草ISP的生物活性，并且黑麦草ISP能够耐受高温，在100℃下结构和活性稳定[10]。

沙冬青中可能包含多种ISP，分子量分别为67、21、50、37.1、28ku。热滞活性分别为 0.46℃（10 mg/mL）、0.45 ℃（10 mg/mL）、0.35 ℃（5 mg/mL）、0.24 ℃（5 mg/mL）、0.15℃（10 mg/mL）。前两种不是糖蛋白。其中50 ku ISP中含11%的α-螺旋、34%β-折叠、55%无规则卷曲。由这些ISP共同作用一起发挥其抗冻活性。

桃树皮中含有具有脱水素蛋白的PCA60，分子量50 ku，含有472个氨基酸残基，其中富含赖氨酸和甘氨酸，热滞活性为0.06℃～0.09℃，具有较强的冰晶修饰能力。

1.4 细菌中冰结构蛋白的分类

细菌中分离提纯冰结构蛋白的研究很少。从南极洲的细菌中有6种细菌可分离出ISP，从菌株Moraxella分离出的ISP为脂蛋白，是第一次报道的冰结构脂蛋白[11]；E.coli的ISP分子量大约为7.4 ku，称为CS74，含大量的亲水基团；研究者还在加拿大北极地区的一种根瘤菌（Pseudomonas putida GR12－2）中发现了一种冰结构蛋白。

1.5 真菌中冰结构蛋白的分类

真菌中冰结构蛋白的研究也非常少，有报道称冬菇（Flammulina velupites）和牡蛎菇（Pleurotus ostreatus）中存在冰结构蛋白。

2 冰结构蛋白抗冻机制的研究

冰结构蛋白主要通过热滞效应、重结晶抑制效应来发挥它的抗冻活性。热滞效应是指冰结构蛋白可以非依数性的降低溶液的冰点，而对其熔点基本没有影响，从而使冰点与熔点之间出现一差值，这个差值的大小就反映了冰结构蛋白的热滞活性，差值越大活性越高。重结晶抑制效应是指冰结构蛋白可以抑制冰晶重结晶，而重结晶是指由于温度波动，已形成的冰晶颗粒进行重新分配，大的冰晶越来越大，小的越小。

由于目前发现的冰结构蛋白种类繁多，基因和结构基本没有同源性，并且分子量大小相差很大，就是从同一物种提出的冰结构蛋白相差也很大，所以造成它的抗冻机制的复杂性。目前公认的抗冻机制有吸附抑制模型、结构互补模型、晶格匹配模型、晶格占有模型、偶极子—偶极子模型、空间屏障学说等。

吸附抑制模型：这种模型是1977年Raymond[12]和DeVries提出的，他们认为冰结构蛋白可以吸附到特异的冰晶c轴表面，通过Kelvin效应抑制α轴方向上的生长，从而阻止冰晶生长，修饰冰晶形态。机制的模型是：一般晶体的生长垂直于晶体表面，假如杂质分子吸附于冰生长的表面，那么需要再外加一推动力（冰点下降），促使冰能在杂质间生长。新加坡国立大学Du[13]等人首次从数量上检测冰结构蛋白的抗冻机制，他们发现冰结构蛋白可以吸附到小晶核和尘埃颗粒上，从而抑制冰晶的成核作用。这为吸附抑制模型提供了有力的证据。但是吸附抑制模型不能完整的解释冰结构蛋白抑制冰晶生长的机理，因此,还有待进一步的完善。

结构互补模型：该模型于2002年由Jia[14]等提出，也称为“受体—配体模型”，其中冰结构蛋白是受体，冰晶是配体。冰结构蛋白表面与冰晶表面之间主要通过不可逆的疏水作用以及范德华力（也包含部分氢键，但是次级作用力）互相吻合，而发挥抗冻活性。加拿大阿尔伯达大学研究人员发现甲虫冰结构蛋白中的规则的苏氨酸排列以最适方式与冰晶表面紧密咬合，排除了水与冰晶的接触，从而抑制冰晶生长。这为结构互补模型提供了有力的证据。进一步证实结构互补模型的证据是[15]，2002年北京师范大学与加拿大皇后大学生化系的研究人员首次将分子轨道计算法应用于冰结构蛋白ISP-Ⅱ，检测到ISP-Ⅱ中的19个氨基酸残基可与冰晶表面相吻合。

其他模型有，1983年由Deviles提出的晶格匹配模型，随后于1988年，Yang等提出的偶极子—偶极子模型，Knigh于1993年在晶格匹配模型的基础上提出了晶格占有模型。但由于鱼类、昆虫、植物、细菌能够耐受寒冷不只是与冰结构蛋白有关，它还与组织中的一些抗冻因子有关，从而使其抗冻机制更加复杂多样，因此需进一步的探讨它的抗冻机制。

3 冰结构蛋白作为食品添加剂的安全性研究

每种新型蛋白作为食品添加剂，应用于食品之前都要对其潜在的危险进行研究，如过敏性等。尽管冰结构蛋白应用于食品中具有巨大的商业价值，但其过敏性也同样带来了争议。Bindslev[16-17]等研究了冰结构蛋白的过敏性，他们主要从三方面来阐述。其一，对冰结构蛋白进行氨基酸序列分析。通过BLAST（局部序列比对基本检索工具）和PIR-NREF（蛋白质信息库）软件测序，与已知的过敏原序列进行比对，发现其与已知过敏原无同源性；其二，过敏原对胃蛋白酶的抗性分析。通过 RP-HPLC、SDS-PAGE、GFC、LC-MC 等方法对冰结构蛋白进行研究，发现通过HPLC或SDSPAGE，冰结构蛋白的生物活性在4 min后下降了一半；其三，平时人体血液中的免疫球蛋白E（IgE）的含量很少以及嗜碱性粒细胞不会释放组胺，当有过敏物质存在时，会诱导产生过敏反应，从而使IgE含量增加，释放组胺，因此，通过检测血液中IgE含量和组胺含量，可以判断该物质是否为过敏原。Bindslev等在添加ISP后，通过Maxisorp RAST（放射免疫吸附法）测定血液中IgE含量不会超过200μg/mL，组胺没有释放。因此通过上述三方面实验，可以断定ISP不会引起过敏反应，是一种安全的食品添加剂，可以放心使用。

4 冰结构蛋白的应用

4.1 冰结构蛋白在食品中的应用

冰结构蛋白作为一种新型的食品添加剂，比较成功的应用于冰淇淋、冷冻面团、肉制品等食品中，它可以有效地抑制冰晶生长，并抑制重结晶，从而提高食品的质量，减少营养的流失。

4.1.1 冰结构蛋白在冰淇淋中的应用

有资料显示，随着生活节奏的加快，高中档冰淇淋和雪糕的销量呈明显上升的趋势，而冰淇淋由于其口感细腻滑润，冰甜可口，色泽鲜艳，味道宜人，现在越来越受到人们的亲睐，并且冰淇淋的样式也越来越多，市面上的种类也是五花八门，像哈根达斯和意大利的软式冰淇淋，但是所有的冰淇淋产业仍面临的问题是如何减小冷冻过程中冰晶的生长和重结晶，尤其是中低端的冰淇淋。而随着冰结构蛋白的研究使人们看到了希望，通过研究发现ISP可以与冰晶表面结合而阻止冰结晶形成，控制其生长，改变冰冻或自然生长过程中冰核与冰晶体的生长规律、生长速度和冰晶体形状和大小，并能抑制重结晶，从而避免产生大的冰晶而影响口感，并可提高其稳定性。我国于2006年首次在食品安全国家标准GB2760上公布冰结构蛋白可以以新的食品添加剂添加到冷冻食品中。在国际上目前只有联合利华公司将冰结构蛋白应用于冰淇淋中，发现冰结构蛋白添加到冰淇淋中可以消除冰渣，而改善质量和口感[18]。其他外国公司还没有研究使用，因此，冰结构蛋白在冰淇淋中的应用前景广阔。

4.1.2 冰结构蛋白在中式冷冻面团中的应用

在国内，江南大学黄卫宁等主要研究冰结构蛋白在中式冷冻面团中的作用。冷冻面团技术是一门新的烘焙食品加工技术，面团经过长时间的冷藏，面团的品质会下降，如醒发时间延长，比容减小等。而研究发现[19]，与空白样对比，添加0.5%ISP的面团可以有效的缩短面团的醒发时间，增大面包比容而减小面包硬度。并经过扫描电镜实验，发现添加0.5%ISP的冷冻面团，经长时间冻藏后，仍然可以观察到明显的面筋网络结构，这说明ISP可以显著保护冷冻面团超微结构。

4.1.3 冰结构蛋白在肉制品中的应用

肉制品经过反复冷冻，由于冰晶不断集聚变大，会对肉制品的组织产生破坏，从而使汁液外漏，营养流失。而加了ISP的肉制品或者在宰杀前24 h将0.01 mg/mL的ISP注射入待宰羔羊体内，均可有效地减少渗水和冰晶的形成，从而保持其原有的组织结构，减少营养流失[20]。可能是因为ISP使部分融化的冰晶缓慢地渗入到细胞内，在蛋白质颗粒周围重新形成水化层，使汁液流失减少，保持解冻食品的营养成分和原有风味。

4.2 冰结构蛋白在农业中的应用

1998年英国York大学Worrall首次发现了植物的ISP基因[21]，2001年尹明安等成功克隆出了胡萝卜的ISP基因。随着各种ISP的基因测序的进行，研究者通过基因工程技术将ISP的基因导入植物体内，并在体内表达，使植物获得抗冻活性，选育出转基因的抗冻植物，扩大了植物的种植范围，打破了植物因寒冷或霜冻等气候而限制了产地和产量。

4.3 冰结构蛋白在医学中的应用

冰结构蛋白能够保护移植的人体器官免受运输过程中因温度的上下波动而生成的冰晶对器官的破坏，并能延长移植器官的寿命，从而为移植手术争取更长时间。

冰结构蛋白还可作为定向药物运输到肿瘤细胞附近，然后控制冰晶生长，从而可定向的冰结和破坏皮肤中的肿瘤细胞，而减少对周围细胞和组织的损伤。

5 展望

上述介绍了冰结构蛋白的分类、抗冻机制、安全性以及在各行业的应用。尽管对冰结构蛋白已经有了很深的研究，并且也认识到了冰结构蛋白具有较高的潜在应用价值，但是不同原料、不同方法研究的绝大多数冰结构蛋白从实验研究到实际生产还面临很多问题，尤其是研究结构与功能之间的关系和如何能更好地实现冰结构蛋白的产业化等。然而，可以预见的是，随着科技力量的发展及科研工作的不断深入和研究者的不断努力，冰结构蛋白必将实现规模化，并会应用到各个领域，为提高速冻食品的品质、生产过程中的节能降耗提供较好的支撑条件。

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