中草药提取物体外抗菌活性测定方法的初步探讨

俞晓丽 王 君 闻 平

(江苏大学附属人民医院检验科，江苏省镇江市电力路8号，212002)

中药药敏试验方法有纸片琼脂扩散法、试管稀释法、平板稀释法、打洞法、挖沟法等，目前我国尚无统一完整的中药药敏试验方法，这给从事中药新药鉴定工作者带来困惑。我们对几种药敏实验方法进行了探讨，并力图寻找一个像西药纸片琼脂扩散法——Kirby-Bauer法一样的一个统一且比较完善、理想的方法。

1 材料与方法

1.1 材料 1)菌种:临床分离大肠杆菌、金黄色葡萄球菌各一株。2)中药:大蒜素获自黑龙江宝岛制药有限公司，黄芩素获自美国SIGMA公司，胡桃楸提取物［1］(本实验室自制)。3)培养基:试验中所用MH液体培养基和MH琼脂培养基均为杭州天和微生物试剂有限公司产品。

1.2 方法

1.2.1 管碟法 将试验菌株接种于营养琼脂平板，37℃培养18h后，用生理盐水洗下，用比浊法配成105CFU/mL菌液，用棉签涂抹于营养琼脂平板，放上特制钢杯，钢杯内径0.5cm，高0.8cm，盛入不同浓度上述各种中药原液0.157mL，37℃培养24h，测量抑菌圈大小。

1.2.2 标准稀释法［2］在试管中用MH液体培养基将各种中药原液稀释为 1/2、1/4、1/8，然后加入105CFU/mL菌液0.1mL，同时设不加中药的阳性对照管，37℃培养18h观察，以MH液体培养基混浊，无沉淀管判为阴性。

1.2.3 平板稀释法 取无菌9cm平皿9个，每个加无菌生理盐水2mL。根据培养皿底面上注明的药物稀释度，在第一个平皿原药液2mL，混匀，取倍比稀释药液2mL至第二个平皿，以此类推至第8个平皿。第9个平皿不加药做阴性对照。在上述的每个平皿中加入试管中的60℃培养基18mL，倒入培养基马上摇匀，摇匀为顺/逆时针7次，摇匀后，平放，冷凝。使药液浓度为1：10，1：20，1：40，1：80，1：160，1：320，1：640，1：1280;用标准接种环取1环受试菌液(1MacFarland单位)划线接种于平皿内，于32℃温箱培养48h，以能抑制细菌生长的最低药物浓度为该药物的最低抑菌浓度(MIC)，重复3次试验，以3次或2次结果相同者为报告依据［3］。9号平板为阴性对照。

1.2.4 活菌计数法 将各种中药配制为原液、1/2液，以0.5mL/管分装在有盖塑料离心管中，然后在每管中加入已配好的105CFU/mL菌液0.1mL，同时设生理盐水对照。试验管和对照管置4℃冰箱保存。参照简易式倾注平板法的计数方法［4］，即将作用后的标本稀释为不同浓度，每个浓度取10μL充分涂抹于琼脂平板，37℃培养18～24h，计数菌落数，换算为每毫升含有的活菌数。对照管在试验前，试验管和对照管在保存不同时间后，用加样器取4℃下作用后的试验液10μL于营养琼脂平板，用接种环充分涂抹，37℃培养24h后用电光菌落计数器计数菌落数。

1.2.5 刃天青微孔板显色法 在96孔微孔板(Costar USA)上实验组加入上述细菌悬液100μL/well，再加入不同稀释度的中药液(100μL/well)，设不加药的细菌对照组和无细菌的空白对照组，每个培养条件设3个复孔。置35℃孵箱培养18h，每孔加入刃天青溶液(5mg/mL)10μL，继续培养2h后在全自动酶标仪上以492nm波长测定实验组与对照组的吸光度(A值)，按下列公式计算:细菌细胞存活率［5］=实验组A值/药物阴性对照组A值×100%。结果判定:根据刃天青微孔板显色法的活菌计数，细菌存活率可套用上述公式。

细菌存活率＜30%则对该药为高度敏感(S);细菌存活率30%～50%则对该药为中度敏感(MS);细菌存活率＞50%则对该药为不敏感(R)。

2 结果与评价

纸片琼脂扩散法中由于中药的煎剂及其他剂型做成的液体都是悬液，药物在固体培养基上扩散受到限制，效果不好，不易得出准确的结果;试管稀释法是一个比较好的方法，但具有试验工作量大，操作繁琐，一个系列稀释度含药培养基只能测一种菌，营养要求高的菌无法培养等弊端，难以推广;打洞法同纸片扩散法，也因中药煎剂都是悬液，颗粒较粗，扩散受到限制，实验结果难以控制，而在临床上不能作为一个标准方法推广;平板稀释法，只需制成两个系列稀释度含药平板，一个稀释度可同时测多种细菌，操作简便，结果准确;采用活菌计数法，用中药原液可以测出用管碟法所不能测出的中药抑菌作用。在1/2浓度中，试管法只能测出20%试验药的抑菌作用，而活菌计数法则能测出所有试验药对细菌的作用。但采用活菌计数法进行实验，在试验前需对试验菌在生理盐水中存活情况进行测定，对厌氧性的菌、营养要求高的菌如肺炎球菌、脑膜炎球菌等显然不能使用此法。试管法、平板法、管碟法抑菌效果有差异，试管法因为中药颜色深，最不准确;平板法不能最大限度提高中药浓度，对于高MIC中药测定不利;管碟法结合了试管法浓度高、准确和平板法显示稳定的优点，比较适合中药MIC的测定。

刃天青微孔板显色法利用活细胞线粒体酶可以将蓝色的刃天青还原为粉红色的的原理，测定细胞的代谢活性及增殖反应，刃天青显色法以其简便、快速、灵敏等优点，愈来愈多地应用于检测各种细菌对化学药物的敏感性［5］，是以上方法中较为理想的一种方法。

［1］闻平，陈蕾.胡桃楸提取物对白念珠菌生长的抑制作用.中国微生态学杂志，2005，17(5)：335-338.

［2］NCCLS/CLIS.Perfrom ance Standards for Antimicrobial Susceptibility testing，fifteenth informational supplement M 100-S15，125(1):44-52.

［3］杨致邦.引起医院内感染暴发流行的马红球菌的生物学特征.中国人兽共患病杂志，1997，12(3):17-19.

［4］村中幸二.尿の定量的细菌检查法.临床检验，1996，30:587.

［5］Sarker SD，Nahar L，Kumarasamy Y.Microtitre plate-based antibacterial assay incorporating resazurin as an indicator of cell growth，and its application in the in vitro antibacterial screening of phytochemicals.Methods，2007，42:321-4.

(2011-10-11收稿)