斑马鱼：构建神经退行性疾病模型的新型模式生物＊

许大平 张在军 李铭源

（中药质量研究国家重点实验室（澳门大学），澳门大学中华医药研究院，澳门 999078）

神经退行性疾病是指一类在中枢神经系统中神经元进行性丧失所导致的疾病状态，主要包括阿尔茨海默病、帕金森病、亨廷顿舞蹈病及肌萎缩性脊髓侧索硬化症等。随着人口老龄化的加剧，神经退行性疾病的发病率在逐年增高，也越来越受到社会的关注。而目前的神经退行性疾病治疗方法无论从数量还是疗效上都十分有限，为神经退行性疾病寻找合适的治疗方法也变得更加迫切。目前的神经退行性疾病动物模型在预测治疗有效性上仍有局限［1］，发展新的神经退行性疾病动物模型并利用之进行有效药物筛选成为一项很有意义的工作。

1 斑马鱼简介

斑马鱼是一种市面常见的观赏鱼类，其体型纤细，对食物和水质要求不高。更重要的是斑马鱼繁殖能力强，雌鱼每周可产卵一次，每次几百枚。其卵子体外受精，体外发育，胚胎发育速度快，胚胎和幼鱼身体透明，便于形态学观察。作为一种脊椎动物，斑马鱼与人类基因组同源性高（约87%），基因组信号调控也与人类有很高的相似性［2］，所以在发育科学中，斑马鱼作为主要模式生物已经有几十年的应用历史。

在人类疾病及治疗方法的研究中，斑马鱼模型的起步较晚，但是发展很快。因为斑马鱼幼鱼体积小（出生后7天约4 mm），能被放进96孔板进行实验，使斑马鱼对化合物量的需求很小，并且能够适应10%Dimethyl sulfoxide（DMSO）浓度的生存环境。这些特性使得斑马鱼在高通量先导化合物筛选上具有很大优势［3］，能够缩短药物的体内研究时间。在神经方面，研究人员相继发现了斑马鱼在学习，睡眠，药物成瘾及其他神经行为表型与人类相似，并且可以定量研究［4－7］。斑马鱼的整个神经递质系统，包括胆碱能，多巴胺能和去甲肾上腺素能通路已经被阐明［8－9］。相比于其他无脊柱模式生物，斑马鱼出生后三天就开始发育功能完好的血脑屏障［10］。这些都说明了斑马鱼模型在神经系统疾病研究上的优势。另外，斑马鱼的诸多特性使其在分子生物学操作上具有很大的灵活性，利用反义吗啉代寡核苷酸法（Morpholino oligonucleotides）在胚胎发育早期对斑马鱼进行特定基因的暂时性沉默已经成为应用广泛的研究方法。在构建稳定的转基因品系方面，利用化学诱变，锌指核酸酶或定向诱导基因组局部突变（Targeting induced local lesions in genomes，TILLING），能够稳定的敲除特定基因。mRNA注射或插入顺式调控元件等可以在斑马鱼基因组中插入致病突变。本文主要围绕斑马鱼构建的神经退行性疾病模型，介绍其在神经退行性疾病相关领域近几年的发展。

2 斑马鱼神经退行性研究及疾病模型

2.1 阿尔茨海默病

阿尔茨海默病（Alzheimer′s Disease，AD）是发病率最高的神经退行性疾病，其在65－69岁人群中发病率为1.53%，而在80－85岁人群中的发病率高达30%［11］。病人脑部病理学特征为细胞外淀粉多肽沉积形成脑部斑块，细胞内神经纤维缠结伴有进行性神经元减少［12］。病人表现为认知功能与记忆逐渐减退和行为错乱，从而严重影响生活质量。阿尔茨海默病是痴呆发生的最主要原因，50%以上的痴呆都与阿尔茨海默病有关。随着人口老龄化的增加，阿尔茨海默病是一个必须面对的严峻问题。阿尔茨海默病的病因和发病机制复杂，至今尚无完全明确。关于其发病机制的主要假说有β－淀粉样蛋白毒性学说，微管相关蛋白tau异常学假说。

已知的一些与AD发病相关的基因，在斑马鱼上都有发现。在家族性早发型常染色体显性遗传阿尔茨海默病例中，其发病被认为与编码β淀粉样前体蛋白（β－amyloid procursor protein，APP）和早老素（Presenilin，PSEN1and 2）的基因突变有关［13］。而载脂蛋白E（Apolipoprotein E，ApoE）和Sorting protein－related receptor containing LDLR class A repeats（SORL1）的基因变异也会导致个体患迟发型阿尔茨海默病风险增加。研究人员已在斑马鱼中发现了两个编码APP的同源基因（appa，appb），与人类的同源性约70%［14］。编码早老素的同源基因psen1和psen2也在斑马鱼上有发现［15－17］。而与AD发病风险相关的ApoE和SORL1在斑马鱼生同样发现了同源基因。这些研究证明了斑马鱼作为AD研究模型的可能性。

β－淀粉样蛋白（β－amyloid，Aβ）的形成是由于β－淀粉蛋白前体（APP）的非正常剪切和错误折叠导致的。Aβ在脑中堆积产生细胞毒性作用，被认为是AD发病的病因之一。在斑马鱼中，发现了人APP的同源基因appa和appb［14］，以及与APP非正常剪切相关的β－内分泌酶和γ－内分泌酶同源基因［15，17］。但是斑马鱼体内内源性Aβ尚未被发现，从而也无从知道斑马鱼体内APP的处理过程与人类的相似性。研究者们对在斑马鱼中建立Aβ毒性模型进行了诸多尝试。在2009年第六届欧洲斑马鱼发育与遗传学会议上，有研究者报导尝试通过插入人突变基因APPswe建立斑马鱼Aβ模型，但是并未显示出明显病理特征。Newman［18］等最近也尝试构建一种新的表达Aβ淀粉样蛋白同时又更易于观察的斑马鱼AD模型用于高通量筛选。他们尝试让Aβ42淀粉样蛋白特异性表达在斑马鱼黑色素细胞中。但是这种转基因品系斑马鱼直到长成16个月的成鱼才表现出明显的色素异常，失去了早期高通量筛选的价值。

tau蛋白是一种磷酸蛋白，具有促进神经元合成和稳定神经元的作用。研究发现AD患者脑中的tau蛋白发生了过度磷酸化，引起微管蛋白组装紊乱，从而导致神经元骨架变质和神经元细胞内神经纤维缠结（Neurofibrillarytangles，NTFs）。Tau在AD发病中的重要意义，吸引了研究者们构建斑马鱼tau模型的兴趣。Chen［19］等发现了编码微管相关蛋白tau在斑马鱼体内的同源基因mapta和maptb。Tomasiewicz等［20］将绿色荧光蛋白（Green fluorescent protein，GFP）标记的人类tau蛋白用显微注射的方法打入1－2细胞期的斑马鱼胚胎中，注射后48 h即可观察到蛋白的缠结，并最终在斑马鱼体内形成于AD病人相似的神经纤维缠结，从而构建出一种斑马鱼的AD模型。Bai等［21］构建了利用斑马鱼enolase－2启动子表达GFP或人突变4－repeat tau，构建了稳定遗传的Tg（eno2：GFP）和Tg（eno2：Tau）品系。在Tg（eno2：Tau）品系中，tau在斑马鱼整个中枢神经系统都有表达并在视网膜，脊髓，轴突和神经元胞体沉积并形成神经纤维缠结。eno2启动子在斑马鱼24－72days postfertilization（dpf）期间表达逐步增加，并可稳定表达至其成年。因此，此研究同时提供了一个理想的调控元件来构建更多神经退行性疾病模型。Paquet［22］也构建了一种稳定遗传的tau蛋白病变的斑马鱼转基因模型：其利用Gal4／UAS表达系统为构建出了荧光蛋白标记的人tau蛋白，并在斑马鱼中迅速重现了与人类似的过磷酸化，神经纤维缠结等病理特征和神经功能与行为学异常等表征。值得一提的是，利用此模型Paraquat等筛选出了一种tau激酶GSK3β抑制剂，提示此模型在药物初期筛选中具有很大潜力。Van Bebber［23］等利用这种tau蛋白病变的斑马鱼模型检测了已进入临床二期实验的能延缓AD病人认知功能减退药物亚甲基蓝对tau蛋白毒性的保护作用，但是亚甲基蓝没有缓解此模型中的任何病理特征。

2.2 帕金森综合症

帕金森综合症（Parkinson’s disease，PD）是继阿尔茨海默病之后第二大神经退行性疾病，它一种影响运动功能的进行性发展的疾病。一般认为与黑质－纹状体的多巴胺能神经通路被破坏有关，其主要病理学特点就是中脑黑质中的多巴胺能神经元大量死亡和Lewy小体的形成。病人一般出现运动缓慢，肌肉强直和震颤。与阿尔茨海默病相似，PD也是多因素诱发疾病，其发病机制复杂，至今尚未明确。研究表明，PD的发病与 α－synuclein［24］，parkin［25］，UCH－L1［26］，DJ－1，PINK－1 和LRRK2等基因突变有关。

由异常的α－synuclein蛋白聚集形成的Lewy小体是帕金森病的主要病理特征之一。但在斑马鱼中并未发现α－synuclein同源基因。但Prabhudesai等［27］构建了过表达人α－synuclein基因的斑马鱼模型，并观察到神经元凋亡。他们利用这个模型验证了新型分子镊CLR01在斑马鱼体内能够成功阻断α－synuclein的聚集，显著改善斑马鱼生存率。这个研究给斑马鱼模型用于抗PD药物筛选提供了良好的例子。

DJ－1，parkin，PINK－1，LRRK2，uch－L1等在斑马鱼中都可以找到相应的同源基因，其中，DJ－1同源性为89%［28］，parkin同源性为75%［29］，PINK－1为62%［30］，LRRK－2同源性为71%［31］，UCH－L1为79%［32］。

在人早发型帕金森病中，编码Parkin蛋白的PARK2基因是被发现突变概率最高的基因。斑马鱼同源基因park2所转录出的蛋白氨基酸序列与人类的有62%的同源性，在关键活性部位90%相同。Flinn等［29］利用morpholino对斑马鱼Parkin进行敲减后，3dpf斑马鱼出现了间脑多巴胺能神经元减少的现象，并且对神经毒素MPTP的敏感性增加。这也是目前为止唯一一个发现与人类PARK2相关帕金森病有相同表型动物模型，尽管现在还不知道斑马鱼中的多巴胺能神经元减少时因为发育的推迟还是真正的神经退行性变，但是这个模型仍然具有很重要的意义。人PARK2基因变异会造成线粒体呼吸链复合物Ⅰ的活性下降，而park2敲减的斑马鱼表现出了同样表征。

在斑马鱼神经系统中，park7表达的DJ－1遍布脑和脊髓［28］，Bretaud发现，在斑马鱼中和哺乳动物中，park7基因的功能具有非常强的保守性。Bretaud等用morpholino对park7进行敲减之后，并没有影响斑马鱼神经系统的发育，但是增加了多巴胺能神经元对氧化损伤的敏感性［33］。而park7敲减的斑马鱼经蛋白酶体抑制剂MG132处理后，表现出经Bax和P53介导的多巴胺能神经元凋亡。阻断P53能够有效抑制这种凋亡。此研究提示park7敲减的斑马鱼可能具有筛选神经保护药物的潜力。

Anichtchik等［30］对斑马鱼PINK1基因进行了敲除，敲除后的鱼出现间脑多巴胺能神经元减少，同时也出现脊柱弯曲，尾部发育不正常等现象。同时，与人类的帕金森病理特点一样，PINK1敲除的斑马鱼也产生了更多自由基。LRRK2是常染色体显性遗传PD中常见的变异基因。Sheng［34］等在对斑马鱼与人类LRRK2的同源基因zLRRK2进行敲除的过程中发现，敲除整个zLRRK2基因会导致斑马鱼死亡，但是敲除zLRRK2的WD40区域却可以造成斑马鱼的类帕金森病病理改变，如间脑多巴胺能神经元减少和行为学异常。但是Ren等［35］最近的研究对此结果提出质疑，认为 WD40区域的敲除虽然消除了zLRRK2的表达，但是并没有导致多巴胺能神经元减少。由此可见，LRRK2基因在斑马鱼帕金森模型上的应用还需要更多研究。

神经毒素是现今最常用的复制帕金森病动物模型的经典工具。常用的神经毒素有1－甲基－1，4－苯基－1，2，3，6－四氢吡啶（1－methyl－4－phenyl－1，2，3，6－tetrahydropyridine，MPTP）以及6－羟基多巴胺。MPTP是一种能够引起动物类帕金森病症状和病理的神经毒素。MPTP于20世纪80年代在美国偶然被发现在人身上有引起帕金森症状作用［36］，后来引入动物实验，用于帕金森病的造模［37］。帕金森现行的治疗药物左旋多巴和司来吉兰都可以改善MPTP诱导的帕金森症状。Lam［38］首先将MPTP应用于斑马鱼幼鱼并观察到其多巴胺神经元的显著性减少，而其他神经元不受影响。McKinley［39］等参照在哺乳动物中的造模，将 MPTP应用于斑马鱼幼鱼中，他又用morphlino和特异性阻断剂分别阻断了神经元细胞膜上的多巴胺转运体（Dopamine transporter，DAT）和星型胶质细胞中的单胺氧化酶－B，均起到了对MPTP毒性的保护作用，由此说明在斑马鱼体内MPTP作用机制与在人类和其他哺乳动物体内大体相同，而不同于线虫等无脊椎动物。这项研究建立了斑马鱼帕金森病的高通量筛选模型。在McKinley之前，Bretaud等［40］在成年斑马鱼上测试MPTP毒性也取得了不错的结果，但是其研究侧重点在于利用斑马鱼研究帕金森病的发病机理。6－OHDA也是一种与MPTP相似的能够造成多巴胺神经元损伤的神经毒素［41］，但是其不能通过血脑屏障，所以一般采取微注射的方式进行给药。

在斑马鱼帕金森模型中观察药物的保护作用，除了观察其行为学改变［42］外，更重要的是观察间脑多巴胺神经元是否减少。而现行的方法无论是原位杂交还是免疫染色操作都比较复杂。研究者一直致力于建立能够直观观察多巴胺能神经元的稳定遗传转基因斑马鱼品系。已报道的几个研究都尝试利用多巴胺生物合成途径中的基因来建立在多巴胺能神经元中特异性表达荧光蛋白的模型［43－46］，但是都不能达成理想的效果。

2.3 亨廷顿舞蹈症

亨廷顿舞蹈症（Huntington’s disease，HD）是一种单基因遗传性神经退行性疾病，主要病因是患者第四号染色体上的huntingtin（Htt）基因发生变异，产生了变异的蛋白质（聚谷氨酰胺），该蛋白质在细胞内逐渐聚集，形成大的分子团。一般患者在中年发病，逐渐丧失说话、行动、思考和吞咽的能力，病情大约会持续发展15年到20年直到最后死亡。目前HD并无特异有效治疗方法，一些药物可以延缓症状但是不能阻止疾病发展。

在斑马鱼中，Htt基因已经被克隆，其表达的蛋白含有3121个氨基酸，与人类的同源蛋白有70%同源性［47］。用morpholino对斑马鱼Htt基因进行敲除后可引发一系列发育变化包括头眼变小，色素变浅等［48］。Schiffer等［49］将绿色荧光标记的N端带有不同长度的聚谷氨酰胺（PolyQ）的Htt mRNA注射入斑马鱼胚胎内，随着PolyQ的增长，胚胎发育中的异常和凋亡就更加明显。这个研究也再次证明了Miller等［50］之前发现的polyQ 56或以上都可以在斑马鱼胚胎中产生包涵体并引起毒性作用。Schiffer等在斑马鱼身上应用了Hsp40和Hsp70两种在无脊椎HD模型中可以polyQ聚集的物质，在斑马鱼上也取得了很好的效果。但是这两种物质却不能阻止polyQ的毒性作用。最近，Williams等［51］建立了一种表达 GFP－Huntington［71Q］的转基因斑马鱼品系，一些在哺乳动物体内阻止polyQ聚集的物质在这个斑马鱼模型中也有同样效果。因此，这个转基因斑马鱼品系以后可以被用来进行治疗HD药物的先导化合物体内筛选。

2.4 肌萎缩性脊髓侧索硬化症（ALS）

Amyotrophic lateral sclerosis（ALS）是一种在脊髓，脑干和运动皮层中运动神经元选择性丢失的神经退行性疾病。主要表现为肌无力肌萎缩。家族遗传性ALS的发病与superoxidase dismutase 1（SOD1）基因的突变有关［52］。Lemmens等用注射mRNA的方法造成SOD在斑马鱼体内的过表达突变。其结果是斑马鱼感觉神经元无形体变化，但运动神经元出现变短和异常分枝等，与人类的ALS病理特点类似。这个模型可能对研究运动神经元对于SOD过表达的易感性有很大帮助。同时，Lemmens也发现，激发血管内皮生长因子（Vascular endothelial growth factor，VEGF）在斑马鱼体内的过表达，会减少SOD过表达对运动神经元的损害，反之则会加剧。这与哺乳动物模型中的效果一样。说明斑马鱼ALS模型至少在一些生理过程方面与哺乳动物模型是相同的。

3 总结与展望

斑马鱼因为其体积小，成本低，繁殖速度快，易于观察以及与人类相对高的同源性和众多的转基因品系，成为了药物初步体内筛选的上佳选择。近年来在神经退行性病变研究领域，斑马鱼的关注度越来越高。尽管与人类中枢神经系统有较大的区别，斑马鱼在基本的神经传导系统、神经元和神经胶质细胞类型以及与疾病相关基因同源性上与人类都很相似。现在，用化学物质造模的神经退行性变模型已经得到了广泛的应用。对斑马鱼与人类疾病相关的基因同源性的研究也有助于对人类神经退行性疾病发病机制的深入了解。越来越多的斑马鱼神经退行性变转基因品系正在问世，为以后新的药物和治疗方法的研究提供了广阔的空间。

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