分子系统学在菌物分类研究中的应用

宋光桃

(湖南环境生物职业技术学院园林学院，湖南衡阳 421005)

分子系统学在菌物分类研究中的应用

宋光桃

(湖南环境生物职业技术学院园林学院，湖南衡阳 421005)

菌物的传统分类主要依赖其形态和生理特征，常引起分类系统意见分歧.分子系统学技术是从遗传的角度反映菌物种群的关系，能更客观地反映菌物的系统进化.通过概述分子系统学的主要技术方法描述了其在菌物系统分类研究中的应用.参28.

分子系统学;菌物;分类

人类认识和利用菌物已有两千多年的历史，在公元前一世纪左右我国所著的《神农本草经》里就有如灵芝、伏苓等菌物的记载了，但“菌物”概念的提出只有几十年的时间，它最早是由我国裘维蕃教授在1991年提出的［1］.广义的菌物包括有真菌、卵菌和黏菌，它们在森林、土壤、湖泊、海洋等处广泛分布，其中有美味可口的著名食用菌，有疗效独特的珍贵药用菌，也有许多植物和动物的病原菌等.它们在工业、农业、医学、环境保护等多方面与人类的生存息息相关.菌物种类多，2008年出版的《菌物字典(Ainsworth ＆ Bisby’s Dictionary of the Fungi，10th Edition)》第10版中就记载了97 861种菌物［2］，故目前世界上已知菌物约10万种左右，我国已知的菌物约为14 700种左右［3］.有专家预计，全世界菌物种类约为150万种，我国也不低于20万种.因此在自然界里还有大量的菌物等待人类去发现和认识，并进而加以开发和利用.传统的菌物分类鉴定是以其形态学特征、生长特性以及生理生化指标为基础的，然而菌物的外观形态特征复杂，它是菌物细胞内部基因与外界环境因素之间综合作用的结果，而且一些菌物的形态特征、生长特性和生理生化指标随着环境的变化也不稳定;另外，还有部分菌物人工培养比较困难或目前根本不能人工培养，难以用形态学的方法进行描述，同时，形态学方法也很难区分形态相似的种、变种及生理小种.因此，用传统方法对菌物进行系统分类鉴定常常会出现误差和引起意见分歧.分子系统学是在分子水平上对生物进行遗传多样性、分类、系统发育和进化等方面的研究，能揭示生物进化的历程和机理.因此在菌物的现代分类系统中引入了分子系统学技术.本文主要简述分子系统学的主要技术方法及其在菌物分类研究中的应用.

1 核酸摩尔百分含量分类技术

在菌物的不同纲、目、科、属、种之间，其 DNA(G+C)mol% 含量是不同的，并且它们都有特定的DNA(G+C)mol%含量.若两菌物间的遗传关系较近，则其个体间的DNA(G+C)mol% 含量就较相似，反之，若两菌物间的遗传关系较远，则其个体间的DNA(G+C)mol% 含量差异就较大.通常若两菌物为同一个种，则其DNA(G+C)mol%含量差异在4% ～5% 的范围内;若两菌物不是同一个种，则其DNA(G+C)mol%含量差异在10% ～15% 的范围内;若两菌物不是同一个属或同一个科，则其DNA(G+C)mol%含量差异达20%～30%［4］.用DNA(G+C)mol% 含量技术方法进行分类重在否定，即两菌物间若其DNA(G+C)mol% 含量差异较大就可判定它们不是同一个种.但若其含量相同或相近则不能肯定它们是同一个种，因为其DNA碱基序列之间可能存在差异，故当两菌物间的DNA(G+C)mol% 含量相同或相近时，还要借助其它方法综合分析才能确定其分类地位.

2 聚合酶链式反应技术

PCR技术是一种在体外快速扩增特定基因或DNA序列的方法.该技术是由Mullis等［5］在 20世纪80年代中期创立的.由高温变性、低温退火及适温延伸等几步反应组成一个周期，循环进行，使目的DNA得以迅速扩增.它具有灵敏度高、特异性强、快速经济、操作简便等诸多优点［6］.用PCR技术来鉴定菌物，其主要作用机理是使用不同的引物，PCR扩增出不同的产物，即选择某一特定引物就可扩增到相应的DNA片段.目前PCR技术结合其它技术(如RFLP技术、RAPD技术等)已广泛用于菌物的检测和分类研究中.

3 限制性内切酶片断长度多态性技术

RFLP技术是利用限制性核酸内切酶能特异地识别DNA分子双链上的特定碱基序列，并在特定序列处切开DNA分子，产生限制性的片段.由于不同菌物个体间的DNA序列存在着差别，若这种差别正好位于内切酶的酶切位点上，并使内切酶能识别的序列变为不能识别的序列或使本来不是内切酶识别位点上的DNA序列变为位于内切酶的识别位点之上，若这时用限制性核酸内切酶对该DNA序列进行酶切时，就会出现少一个或多一个酶切位点，其结果就会出现少一个或多一个酶切片段.这样用同一种限制性核酸内切酶对不同菌物的DNA序列进行酶切时，就会产生长度大小不同、数量不等的限制性酶切片段，再将这些片段经过电泳、转膜、变性，然后用标记好的相应的DNA探针与这些片段杂交，显示出的图谱就可以反映出基因组DNA碱基序列组成是否存在差异.因此，RFLP技术的基础是通过限制性核酸内切酶的酶切片段长度的多态性来揭示DNA碱基序列组成的异同.目前，RFLP技术已被广泛用于基因组遗传图谱构建、基因定位以及生物进化和分类的研究中［7］.RFLP技术在菌物分类上主要用于菌物DNA同源性的比较，如Anderson等［8］利用RFLP技术研究密环菌属(Armillaria)的分类.Tan等［9］利用 RFLP技术研究小麦全蚀病菌(Gaeumannomyces graminis)相关变种rDNA的变异情况.随着PCR技术的问世，在RFLP技术中引入了PCR技术后，人们就能根据自己的目的随意地研究生物体内不同区段的DNA，而且其酶切图谱也更易于分析，使生物体多态性分析更加快速简捷.这一方法在菌物分类研究中也得到了应用［10］.

4 随机扩增多态性DNA

RAPD技术是在1990年由Williams和Welsh等发明并发展起来的，是建立在PCR技术基础之上的一种可对整个未知序列的基因组进行多态性分析的分子技术.其原理是以基因组DNA为模板，以单个人工合成的随机多态核苷酸序列(通常为10个碱基对)为引物，在热稳定的DNA聚合酶(Taq酶)的作用下，进行PCR扩增.其扩增出的每一种DNA片段代表一个遗传位点.扩增出的产物经琼脂糖或聚丙烯酰胺进行电泳分离，经溴化乙锭染色后，再在紫外透视仪上检测扩增产物DNA片断的多态性.扩增产物的多态性反映了基因组的多态性.RAPD技术现已广泛应用于菌物的品种鉴定、系谱分析、进化关系分析、抗病基因定位和遗传图谱构建等的研究中［11，12］.Guthrie等［13］利用RAPD标记技术对采自美国约翰生草及美国、印度、非洲、玻多黎各岛的高梁上15种炭疽病菌分离物(C.graminicola)进行了鉴定，认为这是快速鉴定分离物间的差异的方法.阎培生等［14］利用RAPD技术研究鉴定木耳属的不同菌株，发现用引物S4和S6与供试菌株基因组DNA的结合点少而且保守，其扩增的DNA指纹在木耳属的不同种间特异性明显，故可用此技术快速准确鉴定木耳属的不同种.陈作红等［15］利用RAPD技术研究鹅膏菌属真菌的亲缘关系，认为RAPD技术适合分析种内遗传多样性和亲缘关系，对于分析种间或近缘属间的亲缘关系存在一定局限性.陈永青等［16］利用RAPD技术研究拟茎点霉(Phomopsis)18种29个菌株，其研究结果与形态学分类结果基本一致，多数种内不同菌株间以较高相似性系数聚在一起，而不同种间则以较低水平相聚，说明用RAPD技术鉴定该属种级水平是合理和可行的.

5 扩增片断长度多态性技术

AFLP技术是于1992年由Zabeau和Vos发明并发展起来的基于PCR技术和RFLP技术的DNA指纹技术，是一种选择性扩增限制性片段的技术.由于不同物种的基因组DNA大小不同，利用可产生粘性末端的限制性内切酶酶切研究对象的基因组DNA序列后，可产生分子量大小不同、长度不同的限制性酶切片段，然后使用特定的人工双链接头与酶切的DNA片段连接作为扩增反应的模板，用含有选择性碱基的引物对模板DNA进行扩增，选择性碱基的种类、数目和顺序决定了扩增片段的特异性，只有那些限制性位点侧翼的核苷酸与引物的选择性碱基相匹配的限制性片段才可被扩增.再将扩增产物经放射性同位素标记、聚丙烯酰胺凝胶电泳进行分离，最后根据凝胶上DNA指纹的有无及扩增片段的长度与数量来检验其多态性［17］.由于AFLP技术结合了RFLP技术和RAPD技术的特点，被认为是一种十分理想的分子标记.目前该技术已在遗传多样性分析、遗传图谱的构建、基因定位以及分类学等领域得到广泛应用［18］.并已用于菌物研究中［19］.何月秋等［20］利用AFLP 技术，用 94 对引物分析了稻瘟病菌3个起始菌株和9个致病变异株，发现其中有49对引物能辨别出起始菌株间的亲缘关系以及起始菌株与变异菌株间的关系.9个变异菌株中有4个菌株的条带数变化无明显，5个菌株的条带数减少了1～3条.

6 核糖体DNA基因核苷酸序列分析

核糖体DNA(rDNA)编码的基因核苷酸序列存在着可变区和高变区，在其进化过程中又具有很强的保守性，所以在菌物分类研究中分析其rDNA基因核苷酸序列是研究热点之一.目前常用于鉴定未知菌物核苷酸序列的目的基因片段有18S rDNA、5.8S rDNA和28S rDNA等.位于18S rDNA的5'端与28S rDNA的3'端间的序列被称为ITS序列(internal transcribed spacers，核糖体内转录间隔区)，其中包括ITS1(内转录间隔区1)位于18S r DNA与5.8S rDNA间、ITS2(内转录间隔区2)位于5.8S rDNA与28S rDNA间和5.8S rDNA的基因序列.ITS序列中含有2个不同的非编码区域(ITS1与ITS4).由于ITS序列具有在菌物种间高度变异性及种内稳定性的特征，这就为菌物的分子检测鉴定提供了理想的靶序列［21］，因而使得菌物种的分类鉴定更为快速、准确、稳定、可靠.ITS序列分析已用于菌物种间、属内、近缘属间以至科内系统进化关系的研究中，其保守区DNA序列可作为科、属的鉴别特性，可变区的DNA序列可鉴别种间物种.叶明［22］采用ITS区序列分析研究了粒毛盘菌属(Lachnum)的系统发育关系.李河等［23］采用ITS区的序列分析与形态特征观察相结合鉴定油茶叶枯病菌为小孢拟盘多毛孢菌(Pestalotiopsis microspora).杨红等［24］采用 ITS区的序列分析尖孢镰刀菌(Fusarium oxysporum.f sp.vasinfectum)异核与同核菌株，表明ITS区分析对镰刀菌属内种间鉴别有参考价值.但对种内或种以下的鉴定不适合.唐建辉等［25］利用ITS的通用引物(ITS1/ITS4)扩增西瓜炭疽病菌的ITS区段，并登录GeneBank数据库，将其序列与GeneBank数据库中炭疽菌属的其它24种炭疽菌的ITS序列进行比较分析，研究了炭疽菌属的系统发育情况.

7 DNA分子杂交技术

DNA分子杂交技术又称DNA探针技术，是利用DNA分子的变性、复性以及碱基互补配对的高度精确性，对某一特异性DNA序列进行探查的新技术.其原理是具有互补碱基序列的DNA分子，可以通过碱基对之间形成氢键等方式形成稳定的双链区.在进行DNA分子杂交之前，先将两菌物的DNA分子提取出来，再通过加热或提高pH值等方法，将双链DNA分子分离成为单链(即变性).再将两菌物的DNA单链放在一起进行杂交，其中一种菌物的DNA单链事先用同位素等进行标记.如果两菌物DNA分子之间存在互补的部分，就能形成双链区(即复性).由于同位素等标记被检出的灵敏度高，即使两菌物DNA分子之间形成百万分之一的双链区也能够被检测出来.核酸分子杂交序列的同源性主要以杂交百分率和杂交复合体的热稳定性来衡量.若两菌物之间的亲缘关系越近，则其共有的多核苷酸相同序列就越多，即同源百分率就越高.在菌物分类研究中，除近似种外，其余序列的同源性都较低［26，27］.因此，菌物 DNA 分子杂交技术主要用于鉴定亲缘关系较近的种或种内分离物［28］.

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The Application of Molecular Systematics in the Study of Fungal Classification

SONG Guang-tao
(College of gardening，Hunan Environment-Biologic Polytechnic，Hengyang 421005，China)

The traditional classification of fungi rely on mainly its morphological and physiological characteristics，and cause differences of opinion in the classification system.Molecular systems technologies described the relationship between the fungi populations from a genetic perspective，and can reflect more objectively the phylogenetic relationships of fungi.This article provides an overview of the main technical methods of the molecular systematics and the application in fungi classification.28refs.

Molecular systematics;Fungi;Classification

Q75

A

1671－6361(2012)02－0004－04

2012－05－28

宋光桃(1965－)，女，湖南衡南人，副教授，研究方向:森林保护及微生物学.