TOLL样受体在睾丸炎症反应与精子发生中的功能

闫克芹 韩代书

TOLL样受体在睾丸炎症反应与精子发生中的功能

闫克芹 韩代书＊

（中国医学科学院基础医学研究所细胞生物学系，北京100005）

睾丸局部炎症反应以及系统性炎症疾病均可以损伤雄性生殖能力，近年来对于TOLL样受体（Toll-like receptor，TLR）调节睾丸功能的研究有了较大进展，为认识炎症反应与雄性生殖障碍之间的关系提供了新的线索。TLR介导的炎症信号通路在睾丸内除了抵御病原体外，还可以调节多种睾丸细胞的功能，从而影响精子发生。炎症对精子发生的影响主要由于循环系统和睾丸中炎症因子增多，它们可以破坏生精细胞的正常发育，损害睾丸体细胞对精子发生的正常调节。相关机理的深入研究可能为雄性不育的预防与治疗提供新的思路，本文将综述TLR介导的系统性炎症疾病及睾丸局部炎症反应干扰雄性生育的研究进展。

Toll样受体；炎症反应；睾丸功能；精子发生

1.前言

睾丸局部感染与炎症反应可以损害生育能力，通常表现为抑制雄激素合成、精子数目减少、暂时性丧失生育能力以及感觉不适和疼痛［1］。感染和炎症能诱导机体产生毒性很高的活性氧簇（ROS）和其他毒素，也能诱导产生多种炎症细胞因子、生物活性脂和一些酶。这些物质可以破坏细胞与血管的正常功能，激活免疫细胞，从而损伤机体。局部炎症反应可引起相邻细胞的凋亡、血管损伤、组织纤维化。一些系统性炎症疾病也能损害雄性生殖能力，包括一些并不引起生殖管道感染的疾病，其中的机制所知甚少。

TLR是一类模式识别受体，可以识别多种病原体相关的分子，如脂多糖（LPS）、脂蛋白、核酸等，是介导机体天然免疫反应的关键受体。TLR除表达于系统性免疫细胞外，还广泛表达于其它组织细胞（包括多种睾丸细胞）中，启动系统及组织局部炎症反应，可以调节炎症对雄性生殖能力的影响［2］。

2.LPS诱导的系统性炎症反应对睾丸功能的影响

LPS是革兰氏阴性菌细胞壁成份，可诱导很强的系统性炎症反应，十多年前就被用来研究系统性炎症反应对睾丸功能的影响。LPS在很宽的剂量范围内都能够抑制睾丸间质液产生，降低睾丸和血液中的雄激素（睾酮）水平［3］。这是因为LPS抑制垂体分泌黄体素（LH），也抑制睾丸间质中的Leydig细胞合成睾酮。炎症反应对下丘脑-垂体-Leydig细胞这一内分泌调控轴的作用，已经有很多相关研究［4］。炎症反应过程中可产生多种炎症介质，如 促 炎 因 子 白 介 素 （IL）-1β、肿 瘤 坏 死 因 子（TNF）-α，ROS，氮氧化物和前列腺素。它们作用于下丘脑，抑制LH释放激素的分泌，从而抑制垂体产生LH。同时这些炎症介质也可直接作用于Leydig细胞，抑制睾酮合成酶的表达［5］。

精子发生是一个复杂的、高度有序的细胞分化过程。这一过程需要生精细胞和支持细胞（Sertoli）之间的相互作用，并且受到促滤泡激素（FSH）和睾酮的调节。虽然低剂量的LPS能够显著抑制睾酮合成，但对精子发生的影响却很小。当注射亚致死剂量的LPS时，能在几周内对生精细胞造成很严重的损伤［3］。无论注射低剂量还是高剂量的LPS，睾丸间质血管中的单核细胞和中性粒细胞会瞬间升高，但是并不浸润到血管外的睾丸组织中［6］。在注射高剂量LPS后四周时间内，对精子发生的影响非常特别。注射后24小时，减数分裂中的细线期／粗线期生精细胞（在大鼠Ⅺ-ⅩⅢ期的生精上皮中）的发育被显著抑制。在接下来的六天内，这些细胞以及相邻管腔侧的圆形精子细胞都会提前释放，并且Ⅺ-ⅩⅢ期的精母细胞和精子细胞的凋亡增多。这提出了一个问题：为什么第Ⅺ-ⅩⅢ期的生精细胞会容易受到影响？

值得注意的是，注射LPS后，大鼠的体温并未升高，反而下降，这说明精子发生的损伤并非由睾丸温度升高所致，而在临床上却把感染后体温升高解释为男性生育力下降的原因之一。尽管LPS处理过程中睾丸内的睾酮水平显著降低，但有证据表明睾酮水平降低也不能解释精子发生的损伤：①低剂量注射LPS和高剂量注射LPS对睾丸内睾酮的抑制作用相似，但低剂量的LPS并不导致明显的生精细胞损伤［7］；②即使注射了高剂量的LPS，睾丸内睾酮的含量只会减少70%，而在非LPS处理的大鼠中，当睾酮含量低至20%时，精子发生也能正常的进行［8］；③LPS处理与睾酮缺陷影响精子发生的表型不同，因为雄激素缺陷特异损伤第Ⅶ-Ⅷ期完整精子的形成［9］。

在注射高剂量LPS 3天时间内，睾丸中的血管出现损伤，并且迅速破坏生精上皮［7］，这些损伤与睾丸的氧化应激反应有关，睾丸氧化应激反应包括诱导产生大量的应激蛋白、热休克蛋白60（HSP60）、高移动组合染色体蛋白1和2（HMGB1和HMGB2）以及增强脂质过氧化反应、降低抗氧化活性、干扰线粒体功能及诱导生精细胞凋亡。

这些结果表明，LPS诱导的炎症通过多种机制影响精子发生，其中，抑制Leydig细胞的功能、诱导血管损伤和氧化应激反应都是生精细胞损伤的重要原因。除了这些间接原因，炎症刺激也可以直接作用于生精上皮。这并不需要LPS直接和生精上皮相互作用，因为睾丸间质内的细胞（包括巨噬细胞与Leydig细胞）能被LPS刺激产生多种炎症介质［4］。而且，在系统性炎症反应过程中，循环系统中升高的炎症介质也能进入到睾丸。高剂量的LPS也可能进入生精上皮直接发挥作用，注射后LPS在睾丸中的分布是一个值得研究的课题。

3.TLR在睾丸中的表达

LPS或者其它炎症介质影响精子发生的机理近年来取得了较大进展，主要是由于发现了TLR在睾丸中的表达与功能。炎症是机体应对创伤或者感染的反应，是快速激活天然免疫的机制，同时启动获得性免疫反应过程。宿主模式识别受体（PRR）特异的识别病原体相关分子模式（PAMP）可以激活炎症和天然免疫反应，在细菌、病毒、真菌、原生病原虫上都发现了PAMP。研究比较多的PRR是TLR家族，它们识别细菌和病毒的核酸以及其它一些病原体特有的分子，例如细菌的脂多肽、肽聚糖和LPS［10］。TLR属于Ⅰ型跨膜蛋白，由包外区、跨膜区和胞内区构成。胞外区由富含亮氨酸的重要序列组成，可以识别PAMP和DAMP。胞内区由200个以上的氨基酸残基组成，该序列与白介素-1（IL-1）受体胞内区的保守序列有高度同源性，被称为TOLL／ILIR（TIR）结构域，功能是募集信号传导的接头分子。

人类中已发现10个TLR，在小鼠中又发现TLR11、TLR12、TLR13，但未发现人类的 TLR10［10］。它们主要表达于免疫系统的单核细胞系（如巨噬细胞及树突状细胞），而且也表达于许多组织中的成纤维细胞、上皮细胞，包括雄性生殖系统中的此类细胞［11，12］。TLR激活后的信号传导依赖于TIR结构域与多种衔接蛋白相互作用激活下游一系列信号传递分子。多数TLR通过与衔接蛋白髓系分化因子88（MyD88）相互作用，启动依赖 MyD88的信号通路，导致核因子（NF）-κB及多种有丝分裂激酶（MAPK）（包括P38、AP1、和JNK）的活化，从而诱导炎症基因的表达［13］。而TLR3与TLR4也可通过与含有TIR结构域能诱导干扰素β的接头分子（TRIF）相互作用，启动依赖TRIF的信号通路，导致干扰素调节因子3（IRF3）的激活，诱导Ⅰ型干扰素（IFN-α和IFN-β）的表达［14］。这些细胞因子在抵抗病原体及调节免疫反应中起着重要作用。

另外两类PRR包括核苷酸结合及寡聚化结构域样受体（NLR）家族和视黄酸诱导基因样受体（RLR）［13］。NLR识别胞浆中细菌的 PAMP，一些NLR，例如 Nod1和 Nod2，通过激活 NF-κB 和MAPK起作用，另一些NLR通过诱导产生半胱氨酸蛋白激酶1来激活靶细胞中的促炎因子IL-1β和IL-18，并且启动caspase介导的细胞凋亡通路。RLR识别胞浆中的病毒RNA，激活NF-κB及诱导产生Ⅰ型干扰素。PRR家族还在继续扩大，现在还包括识别真菌的C型凝集素受体（CLR）［13］。

除了在睾丸巨噬细胞和树突状细胞中表达外，TLR也在几种睾丸非骨髓来源的细胞中表达。大鼠和小鼠的Sertloi细胞表达 TLR2、3、4和5，TLR4的共受体MD2和CD14也在大鼠睾丸中表达［15］。而且，大鼠Sertoli细胞中已发现 TLR1、10、11的mRNA［16］，小鼠Sertoli细胞中也表达低水平的TLR6、7和13的 mRNA［17］。到目前为止，已经证实大鼠或者小鼠的Sertoli细胞中的TLR1-6可被相应的配体激活［15，18］。大鼠的生精细胞在一定发育阶段表达TLR2、3、4的mRNA。管周肌样细胞表达TLR3、11和低水平的TLR2、4、6。Leydig细胞表达 TLR2 、3、4及10［15］。尽管生精细胞对TLR配体的直接反应尚未被证实，Leydig细胞和管周肌样细胞都对LPS起反应［19］。位于胞浆内的TLR8和TLR9，还未在睾丸细胞中发现。至于另外的PRR家族，在Sertoli细胞、管周肌样细胞和生精细胞中发现了Nod1的mRNA，而Nod2只在生精细胞中被发现［16］。

4.Sertoli细胞对TLR配体和炎症介质的反应

Sertoli细胞表达TLR可能是炎症能直接调节精子发生的机制。LPS在体外可以抑制Sertoli细胞合成乳酸的能力以及血浆酶原活化剂的活性，它们对Sertoli细胞支持生精细胞的发育起着重要作用，并且LPS还能促进Sertoli细胞产生ROS、降低Sertoli细胞抗氧化的能力［20］。此外LPS可刺激Sertoli细胞表达一系列炎症基因产物，包括IL-1α、IL-6、可诱导的一氧化氮合成酶（iNOS），以及一些免疫调节因子，如激活素 A（Activin A）［21］。除了LPS的受体（TLR4）外，Sertoli细胞还表达其它TLR，可被其它病原体成份激活，例如，病毒RNA可以激活Sertoli细胞的TLR3，诱导表达炎症因子［22］。这些炎症介质在诱导睾丸炎中起着重要作用。

除了TLR外，Sertoli细胞的功能还受一些炎症因子的调控，主要是IL-1α、IL-1β、TNF-α、NO、TGF-β和IFN-γ［23］。而且Sertoli细胞本身就可以分泌这些炎症介质，已证明，Sertoli细胞分泌的IL-1α能够以自分泌的方式刺激IL-6的产生［24］。睾丸间质中的巨噬细胞及Leydig细胞也是炎症因子的重要来源，尽管被刺激后这些间质细胞比其它来源的巨噬细胞产生的炎症介质水平低很多，但表现出明显的炎症反应［18，25］。虽然尚未观察到生殖细胞对TLR配体刺激的反应，但在生理状态下生殖细胞也分泌几种炎症因子，包括iNOS和 TNF-α［26］。值得注意的是，由于生殖细胞难以在体外存活及培养，限制了对TLR在生精细胞中表达与功能的研究。

来自成熟大鼠的Sertoli细胞与性成熟大鼠的Sertoli细胞对炎症反应表现出很大的不同。当用LPS刺激后，来自未成熟大鼠的Sertoli细胞产生的IL-1α大部分存在于细胞内，并不分泌到胞外［21］。相反的是，用相似剂量的LPS刺激成熟大鼠来源的Sertoli细胞，可将具有生物活性的IL-1α分泌到培养基中［23］。这些结果表明细胞内与分泌形式的IL-1α可能在Sertoli细胞不同成熟阶段发挥不同的功能［27］。

5.炎症信号调节生精上皮周期

Sertoli细胞和生精细胞产生的炎症相关分子可以在生理状态下调节生精上皮的正常结构与功能。在整个生精上皮周期中，不同发育阶段的生精细胞可以调节Sertoli细胞表达IL-1α、IL-6、激活素A等炎症因子。在第Ⅷ期的生精上皮中，随着精子释放到曲细精管的管腔，炎症因子的水平会急剧升高［28］。这是由于Sertoli细胞吞噬残体引起的，同时生精细胞也会相应的高表达 NF-κB、TNF-α、iNOS［26］。生精上皮中炎症因子水平不仅仅与精子释放有关，还可以调节精原细胞和初级精母细胞DNA合成、相邻Sertoli细胞之间血睾屏障的开启与关闭，从而允许早期精母细胞穿越屏障进入管腔［29］。IL-1α促进精原细胞和初级精母细胞的增殖，同时也刺激Sertoli细胞分泌IL-6和激活素 A［30］。IL-6和激活素A又会抑制减数分裂的进行［31］。激活素A对不同发育阶段生精细胞的增殖会起促进或者抑制的相反作用［32］。精子释放之后产生的这些炎症因子对后来的精原细胞和精母细胞的增殖与分化具有重要的调节作用。另外，IL-1α、IL-6、激活素 A、TNF-α能调节Sertoli细胞的很多功能，包括乳酸和转铁蛋白的产生［33］，TNF-α可以促进生精细胞的存活［34］。

炎症反应会抑制FSH和睾酮对Sertoli细胞的调节作用。Sertoli细胞几乎一直接触FSH和睾酮，所以这两种激素不会引起生精上皮周期中Sertoli细胞的功能变化。LPS、IL-1α、TNF-α介导的炎症信号调控Sertoli细胞中激活素A及抑制素B的表达［23］，FSH通过诱导合成cAMP与激活蛋白激酶A发挥作用，这两个通路之间具有明显的抑制关系：IL-1α、IL-1β和 TNF-α能抑制FSH 介导的Sertoli细胞中芳香酶的活化及干细胞因子（SCF）的表达，TNF-α还能抑制FSH诱导Sertoli细胞产生乳酸的能力［35］。

Sertoli细胞中的炎症信号通路和FSH信号通路之间相互调节的机理，目前还不清楚。LPS和IL-1α通过 MyD88介导的信号通路，激活 NF-κB、AP1以及 MAPK-p38和JNK起作用，TNF-α通过另外的机制激活TRAFs。IL-1和TNF-α都会激活Sertoli细胞的p38和JNK［36］，但抑制其它类型细胞中MAPK通路和cAMP信号通路之间的相互作用［37］。炎症信号也可调节睾酮的功能：例如，TNF-α促进大鼠Sertoli细胞表达睾酮受体。尽管作用机制尚不清楚，Sertoli细胞和生精细胞产生的炎症因子能够调节Sertoli细胞对睾酮的应答。

另外，IL-1α、TNF-α和 NO 能开启组成血睾屏障的Sertoli细胞间的紧密连接，也能促使Sertoli细胞与生精细胞之间的连接解体［38，39］，这需要抑制连接蛋白表达，调节基质金属蛋白酶的位置和蛋白酶抑制剂的活性，破坏Sertoli细胞肌动蛋白骨架。因此，精子释放后Sertoli细胞与生精细胞产生的炎症因子对打开血睾屏障，使早期初级精母细胞进入生精上皮的管腔起着重要作用。

6.炎症反应在睾丸生理和病理中的意义

精子释放后，生精上皮炎症因子水平的波动可以调节精原细胞的增殖、精母细胞的减数分裂、Sertoli细胞的活性和对激素的应答、开启血睾屏障允许早期初级精母细胞进入管腔。这些事件的启动器是Sertoli细胞吞噬残体。由于单独的吞噬行为不足以引起炎症，因此推测残体中的成份能够通过PRR，如Sertoli细胞的TLR，来激活炎症反应。虽然TLR是识别外来病原体PAMP的受体，但它们也能被机体内源性分子激活。例如，生精细胞中的热休克蛋白（Hsp60，Hsp70）及 HMGB1是多种TLR的配体［40，41］，哺乳动物细胞的 mRNA 可以激活TLR3和TLR7，而细胞内源性CpG DNA能激活TLR9［42，43］。由于单一 TLR敲除小鼠表现出正常的生育能力，因此生精上皮中炎症因子的变化可能由多种TLR调节。由于大部分生精细胞在发育过程中发生凋亡，Sertoli细胞吞噬凋亡的生精细胞时可能会启动炎症基因的表达。因此，炎症信号可能是生精上皮中不同细胞间交流的机制。

尽管有证据表明在其他系统中TLR信号对于维持正常的生理过程起着重要作用［44］，但是TLR在正常精子发生中的作用还缺乏直接证据，需要做更多的研究。另一方面，睾丸细胞表达TLR和其它模PRR对睾丸病理学一定具有重要的作用。Sertoli细胞与生精细胞表达的TLR可能用于防御来自下游生殖管道的病原体［45，46］。生精上皮中炎症信号和精子发生的紧密关系为认识系统性感染与炎症反应对睾丸功能的损伤机制提供了线索。正如前面提到的，在LPS处理的大鼠模型中第Ⅺ-ⅩⅢ期生精上皮中的细胞对急性炎症特别敏感，而这一时期的生精上皮表现出明显的类似炎症反应。因此，推测炎症对精子发生产生的不利影响至少部分原因是由于循环系统和睾丸中炎症介质水平升高所致，它们在精子发生过程中的重要阶段破坏生精细胞的正常发育。

7.结束语

男性不育、睾丸感染、以及由于非病原性炎症导致的慢性阴囊或者会阴疼痛给众多的男性和其伴侣带来巨大的不幸，并为社会的健康保障系统增加巨大的负担。男性不育的比例约为5%，其中大多数明确病因的男性不育与炎症或者自身免疫有关。由泌尿生殖系统细菌感染、性传播疾病以及非生殖系统感染（例如腮腺炎、SARS和肺结核）引起的睾丸炎症经常会导致暂时或者永久性男性不育［47］。炎症信号通路对Sertoli细胞支持精子发生的能力具有重要的调节作用，这解释了为什么炎症通常会影响男性生殖能力。这些过程的调节机理还有待进行深入研究，以增加对男性不育的认识，并最终为预防及治疗提供线索。

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R329

A

10.3870／zgzzhx.2012.01.021

2011-10-10

2011-12-01

国家自然科学基金资助（30971459）

闫克芹，女（1987年），汉族，硕士研究生。

＊通讯作者（To whom correspondence should be addressed）