烫伤大鼠脑底动脉壁内含内皮素-1能神经纤维的形态学变化

林雪群 祝高春 薛国勇 唐 讯

（1南昌大学医学院脑血管研究所，解剖学教研室； 2江西护理职业技术学院外科教研室，南昌330006）

近年来，人们对烫（烧）伤时期内皮素-1（endothelin-1，ET-1）对内脏组织的损伤作了较详尽的研究［1，2］，但人们对于烫（烧）伤后 ET-1对脑组织损伤影响，尤其是烫（烧）伤后脑底动脉ET-1能神经分布及其对脑血管神经源性调节的研究更为少见。本文拟通过对烫伤大鼠脑底动脉ET-1能神经分布的观察，力求探讨ET-1能神经在烫（烧）伤损伤后对脑血管的神经源性调节作用，为深入探讨烫（烧）伤损伤后脑血液循环障碍的发病机制和探讨新的防治措施提供形态学资料。

材料和方法

1.实验动物分组 选用健康 Wistar大鼠，体重280-320g，雌雄不限，随机分为：正常对照组（Control group，C group），不烫伤；烫伤后3h组（3h Scald group）；烫伤后6h组（6hScald group）；烫伤后12h组（12hScald group）；烫伤后 24h组（24h Scald group）；烫伤后48h组（48hScald group）。每组大鼠8只。

2.大鼠烫伤模型的建立 所有实验动物烫伤前一天用10%硫化钠（Na2S）脱去背部的毛，实验前腹腔注射1%戊巴比妥钠（40mg／kg）麻醉，将烫伤仪喷射盘置于大鼠背部固定，将烫伤仪温度设置在109℃，待压力锅内压力达到70kPa时，启动通气开关，使整个通气管道温度加热到所设定值，设定通气时间为9sec，待喷射口蒸气停止，完成致伤过程。烫伤面积约30%，烫伤程度Ⅲ°。烫伤模型制作完成后，立即腹腔注射乳酸林格氏液40ml／kg。

正常对照组：不烫伤，仅腹腔注射乳酸林格氏液40ml／kg。

3.取材和固定 各时相点烫伤大鼠和对照组大鼠用1%戊巴比妥钠（40mg／kg）腹腔麻醉，经升主动脉插管灌注生理盐水150ml，再灌注含4%多聚甲醛的0.1mol／L磷酸盐缓冲液，约1h后取脑。在解剖显微镜下仔细剥离脑底动脉及主要动脉分支（包括大脑前动脉、大脑中动脉、大脑后动脉和基底动脉），剔除蛛网膜，入20%蔗糖磷酸缓冲液浸透过夜。根据 Hsu等人［3］的免疫组织化学ABC法，显示血管神经纤维。

4.免疫组织化学染色过程 ⑴1：20正常羊血清（Vectastain ABC kit美国 Vector公司），用含0.3%Triton X-100的0.01mol／L磷酸盐缓冲液稀释，4oC，孵育1h；⑵ 鼠抗 ET-1（Mouse-anti-Endothelin-1）血清（1：2000Sigma），4oC，孵育48-72h，以后各步骤之间均用PBS浸洗3-5次，每次5-10min；⑶ 生物素结合的羊抗鼠IgG（1：200Vectastain ABC kit，Vector）室温下孵育12h；⑷ 抗生物素－－生 物 素－－过 氧 化 物 酶 复 合 物 （1：100Vectastain ABC kit，Vector）室温下孵育4-6h；⑸ DAB／H2O2液（0.05%DAB／0.01%H2O2）显色5-10min；⑹ 脱水、透明、封片、显微镜下观察。

对照实验：用正常鼠血清或PBS代替一抗重复上述过程。

5.检测指标和统计学处理 脑动脉铺片染色后，用图像分析系统进行检测。测定正常对照组大鼠和烫伤后各组大鼠大脑前动脉、大脑中动脉、大脑后动脉和基底动脉（近脑底动脉环1mm内取样，每条动脉测3个数据的平均值代表该动脉的密度）单位面积中所含ET-1阳性神经纤维分布的表面积密度（面密度＝目标面积／统计场面积）、周密度（周密度＝目标周长／统计场面积）和数密度（数密度＝目标个数／统计场面积），所测数据经统计软件SPSS10.0分析。

结 果

1.正 常对照组大鼠脑底血管ET-1能免疫反应阳性神经纤维分布

正常对照组大鼠脑底血管各主要分支，大脑前动脉、大脑中动脉、大脑后动脉和基底动脉均可见棕褐色的ET-1能阳性纤维（图1-1示大脑前动脉，其余血管因篇幅所限略），似细线状结构，纤维走行大多呈螺旋形和纵行分布。各动脉间ET-1能阳性纤维密度以大脑前动脉最大，依次是大脑中动脉、大脑后动脉、基底动脉（表1，2，3）。

2.烫 伤大鼠脑底血管ET-1能免疫阳性神经纤维分布

烫伤大鼠3h后大脑前动脉、大脑中动脉、大脑后动脉和基底动脉上可见棕褐色的ET-1能免疫反应阳性纤维（图1-2）。似线状弯曲，纤维走行大多呈环行分布，少数呈螺旋形。各动脉间ET-1能阳性神经纤维密度与正常对照组大鼠比较没有明显改变（表1，2，3）。

烫伤大鼠6h后脑底血管各主要分支，大脑前动脉、大脑中动脉、大脑后动脉和基底动脉上可见棕褐色的ET-1能免疫反应阳性纤维（图1-3），似线状弯曲，纤维走行大多呈网状分布。各动脉间ET-1能阳性神经纤维面密度、周密度和数密度与正常对照组大鼠比较明显增加（表1，2，3），经统计学检验，P＜0.05，表明烫伤大鼠6h后组与正常对照组之间脑底血管的ET-1能阳性纤维密度均存在有显著的差异。

烫伤12h后大鼠大脑前动脉、大脑中动脉、大脑后动脉和基底动脉上可见棕褐色的ET-1能免疫反应阳性纤维（图1-4）。似曲线状弯曲，纤维走行大多呈网状分布，少数呈螺旋形。各动脉间ET-1能阳性神经纤维面密度、周密度和数密度与正常对照组大鼠比较显著增加（表1，2，3）。经统计学检验，P＜0.05，表明烫伤大鼠12h组与正常对照组之间脑底血管的ET-1能阳性纤维密度均存在有显著的差异。

烫伤24h后大鼠大脑前动脉、大脑中动脉、大脑后动脉和基底动脉上可见棕褐色的ET-1能免疫反应阳性纤维（图1-5）。似曲线状弯曲，纤维走行大多呈网状分布。各动脉间ET-1能阳性神经纤维面密度、周密度和数密度与正常对照组大鼠比较仍增加 （表1，2，3）。经统计学检验，P＜0.05，表明烫伤大鼠24h组与正常对照组之间脑底血管的ET-1能阳性纤维密度均存在有显著的差异。

烫伤48h后大鼠脑底血管各主要分支可见棕褐色的ET-1能免疫反应阳性纤维（图1-6）。似曲线状弯曲，纤维走行大多呈螺旋形分布，少数呈网状。各动脉间ET-1能阳性神经纤维面密度、周密度和数密度与正常对照组大鼠比较没有明显改变（表1，2，3）。经统计学检验，P＞0.05，表明烫伤大鼠48h组与正常对照组之间脑底血管的ET-1能阳性纤维密度没有差异。

表1 烫伤大鼠脑底动脉ET-1能神经纤维面密度Table 1 The area density of the ET-1ergic nerve fibers on the cerebral arteries in scald atsr（Thearea density：μm2／μm2）

表2 烫伤大鼠脑底动脉ET-1能神经纤维数密度Table 2 The quantity density of the ET-1ergic nerve fibers on the cerebral arteries in scald rats（Thequantity density：μm／μm2）

表3 烫伤大鼠脑底动脉ET-1能神经纤维周密度Table 3 The perimeter density of the ET-1ergic nerve fibers on the cerebral arteries in scald rats（Theperimeter density：μm／μm2）

用替代法作免疫反应对照试验，均呈阴性，表明该反应具有明显的免疫特异性。

讨 论

在一些学者［4］使用电镜和光镜水平证实脑血管富有肾上腺素能和胆碱能神经分布之后，人们［5］已肯定了脑血管含一氧化氮（NO）、血管活性肠多肽（VlP）、神经肽Y（NPY）等肽能神经与脑血管神经源性调节有关，而对于内皮素（ET）能神经的研究甚少，尤其是在脑血管疾病情况下，诸如烫（烧）伤后脑底动脉内皮素能神经分布是否改变，内皮素能神经对烫（烧）伤损伤诱发脑血管痉挛的影响，以及内皮素能神经对烫（烧）伤后脑血管的神经源性调节研究甚为少见。

近几年来，一些学者［6］观察了大鼠烫（烧）伤后内皮素-1（ET-1）对各脏器，如心、肺、肝、肾、肠等脏器的损伤，认为烫（烧）伤早期内源性ET-1参与了烫（烧）伤后内脏损害。但人们对于烫（烧）伤后ET-1对脑组织的损伤，尤其是对脑血管的作用研究甚少。烫（烧）伤可诱发多器官功能障碍，脑作为一个重要的器官，我们设想在烫（烧）伤后亦可引起脑功能障碍。临床上亦有严重烧伤引起大鼠脑水肿、脑梗塞的报到［7］。烫（烧）伤后引起脑水肿、脑梗塞等脑功能障碍的病理机制如何？一直是人们感兴趣的问题。

本文应用免疫组织化学技术观察烫伤损伤后大鼠脑底动脉内皮素-1（ET-1）能神经分布，在正常大鼠脑底血管各主要分支，大脑前动脉、大脑中动脉、大脑后动脉和基底动脉壁均可见棕褐色的ET-1免疫反应阳性纤维，似曲线状，纤维走行大多呈环形和纵行分布。各动脉间阳性纤维密度以大脑前动脉最大，依次是大脑中动脉、大脑后动脉、基底动脉。在烫伤损伤后6h大鼠脑底血管各主要分支，大脑前动脉、大脑中动脉、大脑后动脉和基底动脉亦可见棕褐色的ET-1免疫反应阳性纤维，纤维密度较烫（烧）伤前正常大鼠明显增加，尤以烫伤后12h神经纤维密度增加最大，纤维似粗线弯曲状，分布大多呈网状，少数呈环形和纵行分布，烫伤后24h神经纤维密度仍较大，而烫伤后48h神经纤维密度变化趋于正常，这可能与烧伤后脑组织病理变化有关。

有报道［8］在严重烧伤早期脑水肿时，烧伤后6h和12h脑组织毛细血管密度逐渐增加，伤后24h毛细血管密度趋于减少，本实验烧伤后脑血管ET-1神经纤维变化与严重烧伤早期脑水肿脑毛细血管密度变化趋一致，ET-1可产生强有效而持久的脑血管收缩效应，烫伤后大鼠脑底动脉ET-1神经纤维密度增加，作用于血管平滑肌细胞，可能诱发烫伤后脑血管痉挛和脑血液循环紊乱，提示脑血管ET-1神经纤维变化在严重烧伤脑水肿的病理过程中可能起着重要的作用。

烫（烧）伤后大鼠脑动脉ET-1能神经纤维密度增加是烫（烧）伤早期一系列病理生理变化之一，在烫（创）伤损伤中，实验动物虽未直接伤及大脑，却出现了某种程度的神经、精神异常，推测这一现象可能与中枢神经系统间接受损有关［9］。本实验结果提示：在非颅脑直接损伤情况下，中枢神经系统确有不同范围、不同程度的应激受损，不同的应激强度对中枢神经系统产生不同的影响，导致不同的应激效应，通过对烫伤大鼠脑血管ET-1神经分布的研究，进一步显示中枢神经系统应变内环境紊乱的某些内在联系，是中枢神经系统应激受损的一个重要致伤物质基础。因此，我们强调，一旦严重烫（烧）伤致伤，无论大脑本身有无直接受损，务必注意中枢神经系统及脑局部血液循环在全身应激反应基础上的特殊变化，防止烫（烧）伤后出现脑血液循环紊乱及随之引发的神经机能障碍。

烫（烧）伤大鼠脑底血管ET-1能阳性神经纤维密度增加，提示烫伤后增加的ET-1能阳性神经纤维可能涉及烫伤后大鼠脑血管痉挛的病理发生，脑组织毛细血管通透性增加，脑血液循环障碍，可能成为临床上严重烧伤后引起脑水肿、脑梗塞的机理之一。但仍需要更多的研究提供关于脑血管ET-1神经分布和烫（烧）伤后大鼠脑血管痉挛发病机理的关系，以及在烫（烧）伤时这些神经分布的变化及其对脑血液循环调节的资料。

［1］Zhang Y，Zhang Y.The dynamic variation of nitrogen monoxidum，endothelin-1，and their ratios in blood plasma of burn patients.Chinese J Burns Wounds＆Surface Ulcers，2008，20（1）：9-11

［2］Zhang XY，Liu Y，Zhang SF，et al.Changes in endothelin-1and calcitonin gene-related peptide in myocardium after severe burn and delayed fluid resuscitation in rats at different altitudes on plateau.Zhongguo Wei Zhong Bing Ji Jiu Yi Xue，2005，17（1）：42-45

［3］Hsu SM，Raine L，Fanger，et al.Use of Avidin-Biodin-Peroxidase Complex（ABC）in immunoperoxidase techniques.J Histochem Cytochem，1981；29：577-580

［4］Boysen NC，Dragon DN，Talman WT.Parasympathetic tonic dilatory influences on cerebral vessels.J Auton Neurosci，2009，147（1–2），101–104

［5］Taktakishvili OM，Lin LH，Vanderheyden AD，et al.Nitroxidergic innervation of human cerebral arteries.Auton Neurosci，2010，156（1-2）：152-153

［6］Lv RL，Wu BY，Chen XD，et al.The effects of aloe extract on nitric oxide and endothelin levels in deep－partial thickness burn wound tissue in rat.Zhonghua Shao Shang Za Zhi，2006，22（5）：362-365

［7］Zhang Q，Carter EA，Ma B，et al.Burn-related metabolic and signaling changes in rat brain.J Burn Care Res，2008，29（2）：346-52

［8］黎海涛，应大君，何小川，等 .犬烧伤早期脑水肿时毛细血管密度的体视学研究 .第三军医大学学报，2001，23（2）：179-181

［9］Barone CM，Jimenez DF，Huxley VH，et al.In vivo visualization of cerebral microcirculation in systemic thermal injury.J Burn Care Rehabil，2000，21（1Pt 1）：20-25

图 版 说 明

图1 烫伤大鼠大脑前动脉ET-1能神经纤维分布

1-1：正常对照组大鼠大脑前动脉，示ET-1能阳性神经纤维标尺＝50μm；

1-2：烫伤大鼠3h大脑前动脉，示ET-1能阳性神经纤维 标尺＝50μm；

1-3：烫伤大鼠6h大脑前动脉，示ET-1能阳性神经纤维密度增加 标尺＝50μm；

1-4：烫伤大鼠12h大脑前动脉，示ET-1能阳性神经纤维密度明显增加 标尺＝50μm；

1-5：烫伤大鼠24h大脑前动脉，示ET-1能阳性神经纤维密度增加 标尺＝50μm；

1-6：烫伤大鼠48h大脑前动脉，示ET-1能阳性神经纤维 标尺＝50μm.

EXPLANATION OF FIGURES

Fig.1ET-1innervation of anterior cerebral artery（ACA）in scald rats

1-1：ACA in normal control rat；show ET-1positive nerve fibers，bar＝50μm；

1-2：ACA in scald 3hgroup rat，show density of ET-1nerve fibers increases，bar＝50μm；

1-3：ACA in scald 6hgroup rat，show density of ET-1nerve fibers increases，bar＝50μm；

1-4：ACA in scald 12hgroup rat，show density of ET-1pos

itive nerve fibers increases obviously，bar＝50μm；1-5：ACA in scald 24hgroup rat，show density of ET-1 nerve fibers increases，bar＝50μm；

1-6：ACA in scald 48hgroup rat，show ET-1positive nerve fibers，bar＝50μm.