脂肪干细胞生物学特性研究及损伤修复应用进展

吕爱红 刘广益 王巧稚

脂肪干细胞(adipose-derived stem cells，ADSCs)是从脂肪组织中分离获得的一种具有自我更新及多向分化潜能的干细胞。2001年，Zuk等［1］通过吸脂术从人体脂肪悬液中首次分离获得，并发现特定条件下可以向肌肉、软骨、脂肪、表皮，造血、神经等多种组织分化。脂肪组织和骨髓一样都来源于中胚层，Ugarte等［2］发现 ADSCs与骨髓来源的间充质干细胞(BMSCs)在细胞形态、生长动力学、细胞衰减、多向分化能力及基因转导能力等方面基本相似。ADSCs具有取材容易、创伤小、细胞增殖快、不会引起伦理学争议等优点。因此，它成为医学工作者研究的热点。本文就脂肪干细胞的生物学特性及应用进展作一综述。

1.脂肪干细胞的生物学特性

1.1 形态特征 原代培养的ADSCs，(2～4)小时后开始贴壁，24小时完成贴壁，细胞呈圆形或梭形，，体积小，核浆比例大，随后细胞体积增大，克隆形成并有突起伸出。经过传代，圆形细胞减少，梭形细胞增多，呈平行排列或漩涡样生长。Colter认为形态较小的ADSCs增值能力强，克隆率高，而较大的成熟基质细胞，增殖能力和克隆率较低。随着传代次数增加，细胞形态和排列趋于一致［3］。

1.2 生长周期 细胞周期分析显示:G0/G1期的细胞占69%，S期细胞占24%，G2/M期细胞占8%，提示脂肪干细胞具有较强的再生能力［4］。核型分析显示，多次传代后，ADSCs仍具有正常的二倍体核型，且不随传代次数增加而发生改变，这说明ADSCs具有遗传稳定性。ADSCs倍增时间平均约为60小时。

1.3 免疫表型 目前为止，还未明确ADSCs的特异性抗原标记。与MSCs一样，ADSCs表达CD44，CDl05，STRO－l，CD117和CDl66等间充质干细胞的标志分子［5］不表达造血细胞标志分子 CD34、CD45、CD45、CD80。此外，ADSCs还表达黏附分子CD29，CD44和CD49。CD29对血管发生具有重要作用，CD44在细胞外基质的发育中起关键作用;CD49参与纤连蛋白的细胞黏附［6］。虽然ADSCs和MSCs表达的基本标志是相同的，但也存在一些细微的差异。如 ADSCs表达CD49d，不表达CDl06(VCAM－1);而MSCs恰好相反，或许这可以作为区分MSCs和ADSCs的一个标志［7］。由于ADSCs不表达主要组织相容性复合体Ⅱ和人白细胞DR抗原，最近有研究表明ADSCs能通过作用于机体的树突状细胞发挥免疫负调节作用，参与诱导机体的免疫耐受，并且当ADSCs与异基因外周血细胞共同培养时，不能刺激混合淋巴细胞的反应，这表明ADSCs可用于异体移植［8］。

1.4 ADSCs多向分化潜能 研究证明脂肪干细胞在不同诱导因子的诱导下，能够向脂肪、软骨、成骨、成肌等多个细胞系分化，此为纵向分化［10］。相应地，有实验研究证明，脂肪干细胞还可向神经细胞，肝细胞分化，即横向分化［11］。Guilak等［12］分离培养人脂肪干细胞，并通过套环法获得45个单细胞克隆并传至第四代，然后分别将其向脂肪、骨、软骨和神经方向诱导，结果表明81%的单细胞克隆至少可以分化为其中的一种细胞，52%的可以分化为两种或两种以上类型的细胞，分化为骨、软骨、脂肪和神经样细胞的比率分别为48%、43%，52%和12%。以上证明了成体干细胞是一类具有多向分化潜力的干细胞，尤其向神经细胞方向的分化，有力地说明成体干细胞具有跨胚层的横向分化能力。近年来随着对ADSCs研究的不断深入，也出现了许多新的问题，例如有研究发现，来源于不同个体、不同部位的ADSCs的分化能力有明显差别［13］，具体原因仍不清楚。

2.应用进展

2.1 ADSCs促进创面愈合 烧伤、创伤、糖尿病等引起的皮肤缺损，临床常规治疗方法效果欠佳，干细胞作为种子细胞为皮肤缺损的修复重建提供了新的途径。Yuan等［14］将ADSCs与角朊细胞共同培养确定为实验组，进行划痕实验，建立创伤模型，比较24小时、48小时和72小时后角朊细胞迁徙距离证实发现实验组角朊细胞迁徙明显快于对照组，并认为ADSCs通过直接接触促进表皮角朊细胞迁移;对各组角朊细胞数分析发现，实验组角朊细胞增殖速度高，差异有显著性意义，说明ADSCs可促进角朊细胞增殖和迁移。

Lu等［15］通过在小鼠背部皮瓣基底局部注射等量的ADSCs后7天，分析背部皮瓣血管密度和单位组织内血管内皮细胞数量最大，认为ADSCs有促进血管重建功能。Nambu等［16］将自体脂肪组织干细胞移植于糖尿病病鼠类动物创面的实验中发现，实验组创面上皮形成，肉芽组织较对照组好，毛细血管更丰富。

薛君等［17］实验发现ADSCs可通过增殖分化促进创面愈合。Altman等［18］以丝蛋白－壳聚糖为载体将绿色荧光蛋白1标记的ADSCs移植于鼠类创面，术后8天实验组创面愈合面积较对照组大，术后2周实验组创面部位血管密度高于对照组，成纤维热休克蛋白、平滑肌肌动蛋白和Von Willbrand因子绿色荧光蛋白标记阳性。并可见ADSCs分化成上皮细胞。ADSCs也能通过旁分泌作用于成纤维细胞，促进其分泌I、Ⅲ型胶原和纤连蛋白，促进皮肤表皮细胞的成熟以利于创面愈合和瘢痕缩小［19］。上述研究表明脂肪组织在创面愈合过程中起着关键作用。

2.2 ASDCs和器官修复 Panat-Bernard等人在半固体培养基甲基纤维素中培养鼠类脂肪来源的细胞，并添加重组的造血生长因子，经过3周培养，发现簇状的自发搏动的细胞，并检测电生理学、药理学和亚显微结构的特性，显示与心肌细胞分化相同［20］研究人员在体内实验中，通过血管注射脂肪干细胞可修复受到冰冻伤害的左心室，并在2周后检测到了供体来源的细胞。这些细胞表达心肌特异性转录因子Nkx2.5，troponinI和肌球蛋白重链，与心肌细胞相一致［21］。Miyahara等［22］将ASDCs制成细胞单层薄片直接移植到心肌梗死区域，移植后细胞层增厚，并有一部分细胞分化为心肌细胞，修补变薄的心脏壁，改善了心脏功能。Hironori等［23］发现ADMSCs高表达VEGF、HGF等生长因子，这些生长因子可改善心肌血液灌注，降低心室扩张和重构心室。由此说明，ASDCs是治疗心肌梗死理想的移植细胞来源。

SEO等［24］将加入 DMSO、HGF和OSM 诱导的 ADSCs从尾静脉输入由四氯化碳造成肝损伤的SCID小鼠体内，观察到在体内转化后的细胞能产生清蛋白。TALeNS－VISCONTI等［25］将从人吸脂术中分离得到的ADSCs经体外诱导后，观察到转化后的细胞表面表达CDl3、CD90和CDl05，通过RTPCR检测细胞内有CKl8、CKl9、清蛋白、细胞色素2El、增强子结合蛋白8等的基因表达，提示ADSCs能向肝细胞转化。国内研究研究实验发现，经脾动脉移植ASDCs后肝硬化大鼠模型的血清白蛋白水平提高、血清的总胆红素水平降低、肝灌注量及肝细胞的变性和坏死得到改善［26］。Fang等［27］认为ASDCs极有可能分化为胆管细胞，参与假小叶的改造与重建，从而达到抗肝纤维化的目的。

此外，利用ASDCs分化为平滑肌的能力，可对受损膀胱进行修复与重建。杨进等［28］TGF－β1诱导ASDCs后，RTPCR结果显示细胞表面表达α肌动蛋白、Calpolin，Sm22，MHC表型无表达，α肌动蛋白为平滑肌细胞特异性表达物［29］。上述研究表明，ASDCs细胞的研究发现为心脏、肝脏、胰腺、膀胱等脏器疾病的治疗提供了新的可能性。

2.3 ADSCs和骨髓移植 目前，骨髓移植存在的最大问题就是供体缺乏，但ADSCs联合骨髓移植可以弥补单独骨髓移植的不足。ADSCs和BMSCs具有相同的黏附分子，如CD9，CD29、CD49，也可分泌相同的细胞因子，如 M －CSF、TNF－a、IL－6、IL－7和SCF。当脂肪来源的成体干细胞和造血干细胞共同培养时，可增加CD34+造血干/祖细胞的增殖、分化和活性，促进造血系统重建［30］。Zhu等［31］认为脂肪来源的干细胞能分泌DKK－1，抑制肿瘤细胞K562的增殖。王健民等［32］实验发现MSC体外能够抑制不同来源的白血病细胞增殖，促进白细胞早期调亡。由此说明，ADSCs可能辅助或替代骨髓移植治疗。

2.4 基因治疗的载体 ADSCs的获取及体外分离培养比较简单，扩增容易，且易被外源性基因转染。因此，与造血干细胞相比，ADSCs是一种更为理想的基因治疗的靶细胞。实验证实，体外培养的ADSCs经过介导，易导入外源性基因，在体内长期，高效地表达。Kueerova等［33］利用ADSCs作为药物细胞载体，通过其“归巢”作用成功抑制了小鼠黑色素瘤的生长。由此说明，ADSCs是未来基因治疗的一个非常重要的工具。

3.问题

虽然脂肪源性干细胞的研究已取得了很大的进展，但依然存在着一些问题:①ADSCs特异性标记物尚未确定。②体外分离培养时如何获得纯度较高的ADSCs，尚缺少统一的分离培养纯化模式。③ADSCs虽然可以在不同诱导条件下向多种组织分化，但目前这些分化诱导的机制仍不清楚。④移植外源性ADSCs仍具有一定的免疫源性，因此如何降低免疫源性仍显得很重要。⑤ADSCs大量扩增和长期分化过程中是否引起癌性危害，需要进一步的研究实验证实。⑥ADSCs治疗研究目前仍以动物实验为主，缺乏大量的临床实验。但是，随着对干细胞生物学特性的认识不断加深和干细胞实验技术的不断进步，相信不久的将来，以成体干细胞为基础的细胞工程和组织工程技术将会逐步发展成为新的临床治疗模式，为一些难治性疾病治疗带来新的希望。

1 Zuk PA，Zhu M，Mizuno H，etal.Multilineage cells from human adipose tissue:implications for cell-based therapies［J］.Tissu Engineer，2001，7(2):211 －228.

2 De Ugarte DA，Morizono K，Elbarbary A，etal.Comparison of multilineage cells from human adipose tissue and bone marrow ［J］.Cells Tissues Organs，2003，174(3):101 －109.

3 陆伟，金岩，张勇杰.SD大鼠脂肪组织来源干细胞体外生物学特性研究［J］. 临床口腔医学杂志，2006，22(7):398.

4 李春明，刘毅.体外培养的人脂肪问充质干细胞生物学特性的研究［J］.中国美容医学，2007，16(2):159－162.

5 Silva WA Jr，Covas DT，Panepucci RA，etal.The profile of gene expression of humanmarrow mesenchymal stem cells［J］.Stem Cells，2003，21:661－669.

6 LITs，lt0H，Hayashi，etal.Cellular expression of inte:beta(1)isof cfitical importance for inducing therapeutic angiogenesis by cell implantation［J］.Cardiovasc Res，2005，65:64 －72.

7 De Ugarte DA，Alfonso Z，Zuk PA，etal.Difrerential expression of stem eelI mobilization associated molecules on multi-lineage cells from adipose tissue and bone marrow［J］.ImmunoI LeR，2003，89:267 －270.

8 王红祥，赵浞，毛红，等.脂肪基质细胞对异基因树突状细胞功能的影响及机制探讨［J］.华中科技大学学报(医学版)，2008，37(1):14－17.

9 Lee JA，Parrctt BM，Conejero JA，etal.Biological alchemy:engineering bone And fat from fat-derived stem cells［J］.Ann P1astSurg，2003，50(6):610－710.

10 Patricia A Z，Min Z，Multilineage Cells from Human Adipose Tissue:Implications for Cell-Based Therapies［J］.Tissue Engineering，2001，7(2):211－228.

11 Bin W，Jin H，Yuan G，etal.The differentiation of rat adipose-derived stem celIs into OEC-like cells on collagen scaffolds by co-culturing with OECs［J］.Neuroscience Letters，2007，42(1):191－196.

12 Guilak F，Lou KE，Hani A，etal.Clonal analysis of the difierentiation potential of human adipose lerived adult stem cells［J］.CeII Physiol，2006，206:229 －237.

13 Sen A，Lea2currie YR，Sujkowska D，etal.Adipogenic potential ofhuman adipose derived stromalcellsfrommultipledonorsisheterogeneous［J］.Cell Biochem，2001，81:312 －319.

14 Miyahara Y Nagaya N，Kataoka M，eta1.Monolayered mesenechmal stem cells repair scarred myocardium after myocardial infarction［J］．Nat Mcd，2006，12(4):459 －465.

15 Lu F，Mizuno H，Uysal AC，etal.Improved viability of randed paatern skin flaps through the use of adipose-derived stem cells［J］.Plast Reconstor Surg，2008，121(1):50 －58.

16 Nambu M，Kishimoto S，Nakamura S，etal.Accelerated wound healing in healing-impaired db/db mice bvautologous adipose tissue-derived stromal cells combined with atelocollagen matrix［J］.Ann Plast Surg，2009，62(3):317 －321.

17 薛君，边云，郭泽君，等.体外诱导人脂肪干细胞向内皮细胞分化的研究［J］.中国分子心脏病学杂志，2009，9(1):24－27.

18 Altman AM，Yan Y，Matthias N，etal.IFATS collection:Human adipose silk fibroin-chitosan scaffold enhance wound repair in a murine soft tissue injury model［J］.Stem Cells，2009，27(1):250－258.

19 Kim Ws，Park BS，Sung JH，etal.Wound healing effect of adipose-derived stem cells:a critical role of secretory factors on human dermal fibroblasts［J］.Ddrmatol Sci，2007，48:15 －24.

20 Planat-Benard V Manard C，Andre M，etal.Spontaneous cardiomyocyte diferentiation from adipose tissue stroma cells［J］.Circ Rest，2004，94:223 －229.

21 Strem BM，Zhu M，A lfunso z，etal.Expression of cardiomyocytic markers on adipose tissue-derived cells in a raurine model of acute myocardial injury［J］.Cytotherapy，2005，7:282 －291.

22 Miyahara Y Nagaya N，Kataoka M，etal.Monolayered meseneh3，mal stem cells repair scarred myocardium after myocardial infarction［J］．Nat Mcd，2006，12(4):459 －465.

23 Nakagami H，Morishita R，Maeda K etal.Adipose tissue-derived stromal cells a novel option forregenerative cell therapy［J］.Atheroscler Thromb，2006，13(2):77 －81.

24 SEO M J，SUH SY，BAE Y C，etal.Differentiation of hu-man adipose stromal cells into hepatic lineage in vitro and in vi-vo［J］.Biochem Biophys Res Commun，2005，328:258 －264.

25 TALONS-VISCONTI R，K)NORA A，JOVER R，etal.Human mesenchymal stern cellsfrom adipose tissue differentiation into he-patic lineage［J］.Toxicol In Vitro，2007，21:324 －329.

26 向宏贤，李家平，谭国胜，等.同种异体脂肪间质干细胞与肝细胞移植治疗肝硬化大鼠模型的对照研究［J］.中华普通外科学文献(电子版)，2011，1:10 －12.

27 Fang B，Song Y，Zhao R C，etal.Using human adipose tissue-derived mesenchymal stem cells as salvage therapy for hepatic graftVerSUS-host disease resembling acute hepatitis［J］.Transplant Proc，2007，39(5):1710－1713.

28 杨进，王坤杰，李虹，等.人源脂肪干细胞向膀胱平滑肌细胞诱导分化的试验研究［J］.四川解剖学杂志2011，19(2):33.

29 KASHIWAKURA Y，KATOH，YTAMAYSE K，etal.Isolation of bone marrow stromal cell-derivied smooth muscle cells by ahuaman Sm22alpha promotert in vitro difiercntiation of putative smooth muscle progenitor cells of bone marrow［J］.Circulation，2003，107(16):2078－2081.

30 Li Y，Chen S，Yuan J，etal.Mesenchymal stem progenitor cells promote the reconstitution of exogenous hematopoietic stem cells in Fancg-mice in vivo［J］.Blood，2009，113(10):2342 －2351.

31 Zhu Y，Sun Z，Ham Q，etal.Human mesenchymal stem cells in hibit cancer cell proliferation by secreting DKK－1［J］.Leukkemia，2009，23(5):925－933.

32 王健民，宋宁霞，等.间充质干细胞与造血干细胞移植相关研究进展［J］. 内科理论与实践，2010，5(1):27.

33 Kueerova L，Matuskoya M，Pastorakov A，etal.Cytosinede-a minase expressing human mesenchymal stem cells mediated tumour regression in melanoma bearing mice［J］.Gene Med，2008，10(10):1071 －1082.