沙门氏菌的检测技术进展

刘 喆，张书萧，王少辉，陈晓平，马志永，郭欢欢,3 ，田明尧， 金宁一

（1.吉林农业大学食品科学与工程学院，长春 130118； 2.中国农业科学院上海兽医研究所 动物源性食品安全研究中心，上海 200241）

沙门氏菌是一种可以引起沙门氏菌病的革兰氏阴性菌，是最常见的人畜共患型食源性致病菌之一。消费者食用被沙门氏菌污染的食物12～72 h后即可出现腹泻、腹痛、恶心、呕吐、发热等症状。近年来，沙门氏菌在全球范围内引起的危害呈不断上升趋势。在欧洲，每年有超过16万人感染沙门氏菌，发生率约为0.035%[1]。在美国，每年有超过140万人感染沙门氏菌，直接经济损失超过24亿美元[2]。在中国，每年由沙门氏菌造成的食物中毒事件占到全部食物中毒事件的40%～60%。

由于沙门氏菌血清型繁多，加上超过50种的复杂的各类生化反应，使得传统的沙门氏菌检测方法难以满足实际情况的需要。为探求快速、准确、简单、高灵敏度的检测方法，世界各国学者进行了大量研究，人们已经创建出多种沙门氏菌检测方法，有一些方法已经得到实践应用。

1 传统检测方法

GB4789.4-2010是中国目前规定的食品中沙门氏菌的标准检测方法。

根据沙门氏菌的培养及生化特性，这一方法包括了前增菌、增菌、分离、生化试验和血清学鉴定5个步骤。该方法是目前世界各国普遍接受的标准方法，鉴定结果准确可靠。但是由于沙门氏菌有超过2500种血清型，生化特性各异，使其检验程序十分复杂繁琐，由于检测时需要反复进行细菌培养，因此至少需要4～7 d才可得到准确的检测结果。同时，挑取疑似菌落，生化试验结果判定等许多步骤都依赖于操作者的主观判断。因此，该方法不够简单、客观，且比较耗时。针对传统方法的缺点，有研究者对其进行了改良，比较常用的有以下两种。

1.1 疏水网膜法（hydrophobic grid-membrane fi lter，HGMF） 疏水网膜法对传统检测方法中的常规平皿划线做了改进。样品用疏水网膜过滤，可以浓缩样品中的细菌，除去不必要的生长抑制物等，要检测的微生物被捕获在疏水网膜的小格中，在接种后的疏水网膜上倾入沙门氏菌选择培养基，经适当时间培养后即可计数。该法原理上与国标检测方法一致，特异性和灵敏度与国标方法也一致，操作步骤略为简化，检测时间略为缩短，一般需3 d左右。

1.2 显色培养基法 显色培养基法是在分离培养基中加入沙门氏菌某些特异性酶的底物，该底物通常为无色，经特异性酶作用而显现出一定的颜色，直接观察菌落颜色即可做出鉴定。朱海明等[3]用两种沙门氏菌显色培养基与传统平板DHL对测试菌株和实际样品进行检测，结果表明三种培养基对生鲜食品的检验结果一致，但对熟食样品的检测结果有较大差异，可能是由于熟食样品中的各种添加剂影响了特异性酶和底物的反应。虽然显色培养基的成本较高，性能还有待改善，但是其使用方便，操作简单，可大大缩短检测时间，可以满足应急检测的需要。

2 分子生物学方法

在各种沙门氏菌检测新技术中，以分子生物学检测方法发展最为迅速。随着近年来分子生物学技术的飞速发展，各种以分子生物学为基础的检测方法层出不穷，其原理都是直接针对沙门氏菌的核酸分子特征进行鉴定，具有较大的优越性。

2.1 PCR 即聚合酶链式反应，是一种体外基因扩增技术。1985年由美国科学家Mullis发明，1992年，Rahn首先针对沙门氏菌属特异性invA基因设计出一对引物，对630株沙门氏菌进行检测，检测出626株阳性，检出率为99.4%。因为PCR技术具有简便、快速、敏感性好、特异性强等优点，各国学者均致力于PCR方法检测沙门氏菌技术的研究，已经针对沙门氏菌多个属种特异性靶基因设计出多种检测方法，常规PCR方法也已经衍生出许多新的PCR检测技术，比较常见的有Multiplex PCR，Nested PCR，RT-PCR，Real-time PCR等。

2.1.1 Multiplex PCR 即多重PCR，是为了提高检测效率，降低检测成本而发展起来的一种PCR技术。它在一个反应体系中同时加入多对引物，可以同时扩增多个目的基因，可以同时鉴定多种致病菌、血清型和耐药基因等。Echeita等[4]根据沙门氏菌鞭毛素基因fljB设计引物，利用多重PCR检测出沙门氏菌不同的H2相抗原。Camila等[5]采用多重PCR技术同时扩增沙门氏菌属特异性基因ompC、肠炎沙门氏菌SdfⅠ基因、伤寒沙门氏菌ViaB基因和鼠伤寒沙门氏菌Spy基因来检测家禽肉的沙门氏菌污染及常见血清型的流行情况。结果表明，阳性检出率高于传统检测方法，且同时可确定肠炎沙门氏菌血清型。多重PCR的关键在于引物的设计，必须保证几对引物的退火温度比较接近，扩增产物大小差别在电泳检测时足以被区分开。

2.1.2 Nested PCR 即巢式PCR，是为了减少非特异扩增，提高检测特异性而发展起来的一种PCR技术。Saroj等[6]设计了两对引物，第一对引物扩增的目的片段长度为1.2 kb，第二对引物以第一对引物的扩增产物为模板，扩增的目的片段长度为375 bp。采用巢式PCR方法对人工污染样品和食品样品检测，所有沙门氏菌阳性样品均检测出单一的375 bp条带，且最低检出率为4 CFU/25g样品。但是巢式PCR反应中途需要打开反应管加入第二对引物，容易导致反应体系被污染。

2.1.3 RT-PCR 即反转录PCR，与针对细菌DNA的其他PCR方法不同，RT-PCR以细菌mRNA反转录来的cDNA为模板进行扩增，因为mRNA只在活细菌中才能稳定存在，所以只有活细菌才能被检出。Nancy等[7]针对rpoD基因设计引物，通过RT-PCR方法分别对活的、被加热杀死的和被酒精杀死的沙门氏菌进行检测，活菌均检测出目的条带；被加热杀死的细菌分别放置在4℃和37℃环境中保存，1 h后检测，均无目的条带；被酒精杀死的细菌放置在37℃环境下1 h后检测无目的条带，放置4℃直至48 h后才有目的条带出现。证明RT-PCR方法可以有效的检测出样品中有无活菌存在，防止了假阳性结果的出现。但是因为mRNA的极不稳定性，RT-PCR检测技术对检测人员的要求较高，使其推广应用受到一定限制。

2.1.4 Real-time PCR 即实时荧光定量PCR，可以在PCR进行的同时，通过检测反应体系中的荧光信号强度得到检测结果，大大提高了检测敏感度，省略了后续分析过程，便于自动化检测，节省时间的同时也免除了电泳过程中DNA染色剂对人体的危害。Malorny等[8]使用TaqMan探针对肠炎沙门氏菌所特有的毒性质粒上的Prot6e基因进行扩增，79株19种不同噬菌体型的肠炎沙门氏菌有75株检测阳性，119株非肠炎沙门氏菌均检测阴性，对禽肉和鸡蛋的冲洗液进行检测，结果与常规检测方法100%符合，最低检出限为3 CFU/50 mL。Seo 等[9]采用Real-time PCR方法扩增沙门氏菌D型菌株特有的sefA基因对鸡蛋样品的检测结果与常规检测方法100%一致，最低检出限为1 CFU/600 g鸡蛋清洗液。Real-time PCR检测技术的灵敏度大大高于常规PCR，但是它的检测特异性同样完全依赖于引物，并不比常规PCR更高，且探针价格昂贵，不利于基层推广使用。

2.2 基因芯片（DNA chip） 基因芯片是一种固定有很多已知序列DNA探针的硅片或玻片。将经过荧光标记的样品分子与基因芯片上的DNA探针进行杂交，通过检测每个探针分子的荧光信号强度以得到样品分子的数量和序列信息，基因芯片表面的DNA探针从几十到几百万个不等，可以一次性检测多种病原菌，并同时得到病原菌的耐药性等情况。Cremonesi等[10]基于细菌的16S rRNA基因设计的基因芯片，可以用于检测牛奶中包括沙门氏菌在内的15种致病菌。基因芯片技术自动化程度高，具有很好的发展前景，但是目前对于样品的前处理，大量信号的获取和分析上，仍有待进一步的研究。

2.3 环介导等温扩增技术（loop-mediated isothermal amplif i cation，LAMP） 2000年日本人 Tsugunori Notomi等开发出来的一种新的核酸扩增方法[11]。LAMP法是利用链置换 DNA 聚合酶（Bst DNApolymerase），在65℃左右恒温条件下1 h内即可将靶基因扩增109～1010倍。LAMP技术的原理是针对靶基因的6个区域按照规定的顺序设计4种特异的引物，因此LAMP技术扩增的特异性很高，只要出现扩增就可以判定靶基因存在。同时，在 DNA延伸合成过程中，从dNTP中析出的焦磷酸离子与反应溶液中的镁离子结合，会产生白色的焦磷酸镁沉淀。因此只要用肉眼观察白色混浊沉淀，就能鉴定扩增与否，而不需要繁琐的电泳和紫外观察等过程[12]。并且LAMP只要在扩增DNA试剂的基础上加上逆转录酶和RNA酶抑制剂，就能一步实现RNA的扩增。

LAMP技术具备操作简单、特异性强、反应快速、灵敏度高、可直接扩增RNA、无需特殊设备等优点，LAMP技术在微生物检测方面上得到了广泛的应用。Yukiko等[13]对227株沙门氏菌和62株非沙门氏菌通过LAMP技术进行检测，检测结果和PCR检测结果完全符合，而且灵敏度比PCR技术更高，最低灵敏度可达2.2 CFU。但是LAMP技术的高灵敏性同时也导致了其反应产物一旦开盖，极易造成气溶胶污染，从而形成难以清除的持续性假阳性。解决这个问题的方法主要是不开盖检测或者实验室的严格分区。此外，LAMP技术不能做多重扩增以及引物设计要求较高的缺点也在一定程度上限制了它的发展和应用。

3 免疫学方法

免疫学检测方法的原理是抗原抗体的特异性结合反应，再辅以各种免疫放大技术，以达到鉴别细菌的目的。免疫学检测方法一般无需特殊仪器，且反应成本较低，易于基层推广，因此在沙门氏菌的检测中占有重要地位。

3.1 酶联免疫吸附试验（enzyme linked immunosorbent assay，ELISA） Kryinski于1977年首次把ELISA方法应用于食品沙门氏菌的检测。因为沙门氏菌血清型复杂，最初的ELISA检测方法假阳性率很高，直至20世纪80年代单克隆抗体技术逐渐成熟以后，Robinson和Mattingly等建立了直接ELISA法，通过单克隆抗体大大降低了假阳性率，使ELISA方法得以在基层逐渐推广开来。但ELISA方法的灵敏度较分子生物学方法低，且必须经过增菌筛选纯培养步骤，因此难以在短时间内得到检测结果。

3.2 荧光免疫分析法（ fl uoroimmuno assay，FIA）FIA法的基本原理是将荧光素标记在靶细菌特异性抗体上，使其与样品中的靶细菌特异性结合，在荧光显微镜下观察荧光现象的技术。FIA法特异性好，但其灵敏性较分子生物学方法有一定差距，且反应成本较高。Cloak等[14]等采用一种表面吸附荧光免疫分析法对20份牛肉样品和80份鸡肉样品进行检测，检测出31份阳性，与常规检测方法完全一致，最低灵敏度为103-5CFU/mL。

3.3 免疫磁性分离法（immunomagnetic separation，IMS） IMS技术是将特异性抗体偶联在磁性颗粒表面，通过与样品中靶细菌的特异性结合和外加磁场的作用，使靶细菌得到分离、浓缩。IMS技术直接检测细菌特异性好，但灵敏度低，因此近年来，IMS技术主要用于与ELISA、PCR等其他检验方法相结合，可大幅度提高分离效率和检测敏感度。

4 电阻抗法

电阻抗法的原理是微生物在生长和繁殖过程中可使培养基中电惰性的大分子底物，如碳水化合物、蛋白质、脂肪等营养物质代谢为电活性的小分子产物，如氨基酸、乳酸盐、醋酸盐等，从而导致培养基的导电性增加，电阻抗降低。不同微生物在特定的培养基中的代谢活性均有所差异，同时如果微生物的起始数量不同，出现指数增长期的时间也不同，因此电阻抗法不仅可以定性鉴定微生物的种属，还可以定量的检测微生物初始含量。Yang等[15]使用微电极结合IMS技术测量沙门氏菌在BHI培养液中的阻抗变化，可以在8 h或1.5 h内检测出初始浓度为101CFU/mL或106CFU/mL的沙门氏菌。电阻抗法可以实时检测细菌的生长繁殖状况，且方便自动化控制，易于大规模样品的检测。但是电阻抗法的影响因素较多，检测过程中容易出现假阳性，特异性还有待提高。

5 生物传感器（Biosensor）

生物传感器是由生物分子识别原件和信号转换器组成的分析装置，工作原理是生物分子识别原件与待测物质发生生物学反应，信号转换器将反应产生的信号转换成可处理的电信号或光信号等。生物传感器的特异性由生物分子识别原件决定，敏感性则由生物分子识别原件和信号转换器共同决定。生物传感器具有分析速度快，自动化程度高，对使用者要求低等特点，可以满足野外现场分析的需求。Pathirana等[16]将沙门氏菌多克隆抗体固定在石英晶体表面的声波装置上，沙门氏菌同表面的多克隆抗体结合后会改变石英晶体的谐振参数，当细菌数目介于102～107个时，这个变化与信号转换器转换成的电压的变化成线性关系。此传感器的最低敏感度为102个细菌/mL，反应时间小于100 s，室温保存32 d仍可保持75%的敏感度。现在生物传感器面临的主要问题是生物分子识别原件的寿命有限，生产成本较高。此外，生物传感器的特异性、敏感性和有效数据处理方法也有待提高。

6 噬菌体法（phage）

噬菌体（phage）是一类可以感染细菌的病毒，分为烈性噬菌体和温和噬菌体两种,其中用于细菌检测的主要是烈性噬菌体。很多烈性噬菌体具有高度的宿主专一性，只侵染特定属或种的细菌，并迅速繁殖，导致宿主细胞裂解，在双层平板上形成肉眼可见的噬菌斑，根据噬菌斑的有无和形态可以判断待检细菌的种属。

Keils等证明O-I噬菌体对沙门氏菌属内裂解率为95.0%～99.6%之间，属外误差为0%～2.33%之间。因此应用沙门氏菌O-I噬菌体对沙门氏菌的检测结果是可靠的。GB4789.31-2003是我国现行的应用噬菌体检测肠杆菌科细菌的标准方法。

噬菌体检测方法具有快速、低成本等优点，而且还可以区分死活细菌。但是当样品中沙门氏菌数目较少时，可能无法形成噬菌斑，造成假阴性结果。Rees等提出了噬菌体扩增法来解决这一问题。该方法先将噬菌体和待检样品混合，待噬菌体侵染入细菌后，将游离噬菌体用灭病毒剂灭活，然后中和灭病毒剂，将可被同一噬菌体裂解的辅助菌加入样品中，倒双层平板培养，释放出的子代噬菌体裂解辅助菌形成可见噬菌斑。

此外，噬菌体还可以和很多其他检测方法联合使用来提高检测效率。

7 联合方法

单一的检测方法总是有其难以克服的缺点，因此近年来对沙门氏菌快速检测方法的研究更多集中在多种方法的联合使用上。

7.1 IMS-PCR 将样品用免疫磁性分离法处理后用PCR方法检测可以减少前增菌步骤消耗的时间，保持了PCR方法的高特异性，还可以提高其敏感性。Wang等[17]将IMS技术与PCR技术相结合，建立了快速检测牛肉中沙门氏菌的方法，显著减少食品成分对PCR反应的影响，可以在24 h以内完成对食品样品的检测，灵敏度达到 103CFU/g。

7.2 IMS-ELISA 与IMS-PCR方法一样，将经过IMS方法处理后的样品进行ELISA方法检测同样可以缩短检测时间，提高检测敏感性。Taha等[18]

将鸡翅样品在蛋白胨水中培养4 h，用IMS技术浓缩分离沙门氏菌，然后用ELISA方法检测，整个反应可以在8 h内完成，特异性高，检测灵敏度达1.6×103CFU/mL。

7.3 噬菌体-电阻抗法 通过电阻抗法检测样品中的靶细菌，对培养基的要求很高，需要仅靶细菌在该培养基上生长，其他菌都被抑制。而沙门氏菌因菌型复杂，一种培养基很难达到这种要求，因此容易造成检测结果假阳性。将噬菌体和电阻抗法联合使用，就可以解决这个问题。使用沙门氏菌专一性噬菌体裂解样品中的沙门氏菌，观察培养基的电阻抗变化，得出检测结果。该方法可以大幅度提高电阻抗法的特异性和敏感性。Amorim等[19]用此方法，采用3种特异性噬菌体检测12种沙门氏菌，每一种菌和它们的特异性噬菌体共同放在胰蛋白胨大豆肉汤中培养，通过观察电阻抗随反应时间的变化成功检测出所有沙门氏菌。

7.4 噬菌体—生物传感器 将噬菌体应用在生物传感器上有利于提高生物传感器的特异性，提高有效信号的比率，使其可以在更复杂的环境中完成检测。Li等[20]将鼠伤寒沙门氏菌E2噬菌体连在无线磁弹性传感器上，在湿润的环境中，将传感器直接放在经过人工接种沙门氏菌的土豆表皮上30 min传感器成功检测出接种浓度在5×102CFU/mL以上的土豆表皮上的沙门氏菌。

7.5 噬菌体—分子生物学 目前噬菌体被广泛用作遗传工程中外源基因克隆和表达的载体，通过噬菌体将绿色荧光蛋白基因（gfp）等报告基因插入到靶细菌DNA中，通过检测报告基因的表达，即可得到靶细菌的检测信息。Kuhn等[21]把细菌荧光素酶基因（lux）通过噬菌体Felix01转移到沙门氏菌中，可在16 h内检测出样品中的沙门氏菌。

8 结论

随着人们对食品安全问题的关注，沙门氏菌作为重要的食源性致病微生物也得到人们越来越多的关注，沙门氏菌的检测方法也得到了很大发展。其中以分子生物学技术为基础的检测方法发展前景最好，它从基因水平上检测沙门氏菌，检测的同时可以得到沙门氏菌耐药性，遗传性等信息，为沙门氏菌的防治和溯源提供信息。以免疫学为基础的检测方法检测时间也较传统方法有所缩短，而且其检测成本较低，因此也在食品检测中得到了广泛的应用。这两类方法经过评估和验证后，已经被很多国家接受并设为标准检测方法[22]。LAMP技术、基因芯片技术、联合检测技术等新兴的沙门氏菌检测技术，还需要在各种不同的食品中进行系统、详细的验证和评估后，才有可能在将来被广泛接受，成为新的标准检测方法。与此同时，传统方法虽然在检测效率等方面远落后于新兴技术，但是因其可以得到细菌的纯培养物，为微生物学和流行病学研究提供必需的材料，所以仍不能完全被新兴的方法取代。

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