单唾液酸四己糖神经节苷脂钠质控研究进展

任丽萍，孟姜姜，高志峰，范慧红

(1．中国食品药品检定研究院，北京 100050;2．华东理工大学，上海 200237)

单唾液酸四己糖神经节苷脂钠质控研究进展

任丽萍1，孟姜姜2，高志峰1，范慧红1

(1．中国食品药品检定研究院，北京 100050;2．华东理工大学，上海 200237)

单唾液酸四己糖神经节苷脂钠(GM1)是从猪脑中提取制得的对神经细胞功能损伤具有作用的物质。本文对近年来GM1质量标准、质量控制和检测方法进行了综述。

单唾液酸四己糖神经节苷脂钠;检测方法;质控研究

神经节苷脂(Gangliosides)是由Emst Klenk在1935年研究Niemann Pick病人组织内脂类成分时发现。30多年前，Ceccarelli等首次把外源性的神经节苷脂用于活体实验，以证实其提高损伤神经元的再生能力。单唾液酸四己糖神经节苷脂钠(Monosialotetrahexosylganglioside Sodium，GM1)系由亲水的唾液酸寡糖基团和神经酰胺部分组成。GM1包括相对分子质量为1 568．84和1 597．18的两种单体。

GM1具有保护细胞膜、促进神经生长、恢复神经功能等作用，主要用于治疗中枢神经系统疾病。GM1的检测方法报道很多，包括高效液相色谱法(HPLC)、液相色谱-质谱联用法(LC-MS)、毛细管电泳法(CE)等，用于检测提取过程中GM1的质量控制、GM1制剂的质量控制及其稳定性考察。本文对我国市场上的GM1原料和制剂的质控现状进行了综述。

1 GM1的原料制备和质量标准

GM1是由猪脑提取制得，我国GM1的原料生产企业已经建立起规模化的色谱分离和纯化技术。原料的提取各家工艺并不完全一致，但基本都包括神经节苷脂混合体的提取、神经节苷脂钠混合体的提取、GM1的提取以及GM1粗粉的纯化等步骤。GM1原料的生产厂家7个，批准文号7个。

经国家药监局药品数据库查询，GM1注射液的原研产品主要有阿根廷的施捷因和巴西的重塑杰。我国的GM1制剂主要有GM1注射液和注射用GM1两种。其中，GM1注射液生产厂家7个，批准文号11个;注射用GM1生产厂家2个，批准文号5个。原料和制剂的法定质量标准均为企业注册标准。

2 生产现状和存在的主要问题

笔者实验室正开展对注射用GM1和GM1注射液的评价性抽验工作，其中抽取了GM1注射液7个厂家、2个规格的53批次样品，抽取了注射用GM1 2个厂家、2个规格的9批次样品。分别按照各自注册标准对样品进行了检验，在检验过程中我们发现各标准项目的设置和限度等均有较大差异，除性状、澄清度、颜色和安全性检查项目外，标准中差异较大的项目主要有含量测定和有关物质检查项。各企业标准含量测定和有关物质检查方法一致，但流动相的组成完全不同。由于各企业试行标准还未统一转正，目前无GM1含量测定用国家对照品，因此，按各企业试行标准检验的法定检验结果还不能完全如实反应产品质量。

3 GM1的质控研究

GM1在提取过程中可能引入其他神经节苷脂类化合物，因此，检测方法和检测条件的选择对检测结果影响很大，文献报道的结构研究比较少，含量和有关物质的分析方法主要有HPLC法、HPCE法和LC-MS法。

3．1 结构研究

王海龙等［1］以牛脑为原料，以国产硅胶代替进口的Iatrobeads大颗粒硅胶，利用萃取、凝胶色谱的方法，从牛脑中提取了较高纯度的神经节苷脂，其紫外光谱最大吸收波长为195 nm;通过红外光谱研究证明在提纯的产品结构中含有唾液酸分子的结构片段;利用原子力显微镜观察其在水中的聚集体微观形貌，在纳米范围内得到了较为清晰的表面形貌图，对其大小进行了分析研究，为GM1的开发利用提供了理论依据。

3．2 含量测定

3．2．1 柱前衍生HPLC 徐桂芸等［2］报道中的化学衍生方法包括全苯甲酰化反应、羰基与含氮亲核试剂的加成反应、唾液酸的羧基与酰甲基溴反应。孙丽华等［3］通过选择流动相、色谱柱、衍生试剂等条件，研究建立了一种柱前衍生HPLC测定神经节苷脂的分析方法，较为简便、快捷、结果准确。

3．2．2 氨基柱 HPLC 由于柱前衍生 HPLC，操作繁琐，条件苛刻，郑永彪等［4］建立了GM1的离子对HPLC，采用 Lichrospher 100 NH2色谱柱，通过组成简单的流动相、等度洗脱，不经衍生而直接分离测定了GM1及其制剂的含量。刘勤等［5］报道中采用NH2柱对GM1进行含量测定，考察了不同pH、流动相配比及洗脱条件，结果表明在pH 5～6的范围内分离效果较好，并确定了最佳梯度洗脱条件。该法专属性强，灵敏度较高，精密度好。尕瑞等［6］采用Lichrospher 100 NH2色谱柱建立了分离测定神经节苷脂中唾液酸的HPLC方法。氨基键合相在酸性水溶液中可作为一种弱离子交换剂，与游离唾液酸、神经节苷脂分子中唾液酸上的羧基和羟基作用而得以分离样品中的各组分，简便、快速、准确，重现性好，适用于唾液酸的测定及神经节苷脂类药品的生产及临床应用中的质量控制。

3．2．3 反相柱法 由于神经节苷脂的一端是亲水的糖链，另一端是疏水的脂肪链，所以反相高效液相色谱更适合于它的分离。较早的文献中报道了一些实验室使用十八烷基或辛基键合硅胶柱，甲醇-水作为流动相，神经节苷脂按其含唾液酸基数目的差异得以分离。反相柱不但可以分辨出相差一个糖残基的神经节苷脂，而且对于唾液酸在糖残基连接位置不同的神经节苷脂以及其它异构体也有高的分辨率。刘勤等［7］报道了采用反相C18柱建立了注射液中GM1的含量测定方法，具有快速、准确、操作简单、专属性强等优点。张小宁［8］研究了HPLC测定GM1含量的方法，比较了反相法C18柱、正相NH2柱和衍生化-反相C18柱三种测定方法，这三种方法都具有方法灵敏度较高，精密度好的优点。

3．2．4 LC-MS 随着色谱质谱联用技术的不断发展，液质联用技术也被应用于神经节苷脂的分析测定［9］。金一宝等［10］使用HPLC-MS法首次对奶粉中的GM1进行了测定，结果表明，该法高效、灵敏、准确度高，可用于奶粉中GM1的含量测定。

3．2．5 其他方法 电迁移方法，尤其是毛细管区带电泳技术(CZE)，是应用最广泛的分析检测糖类结构的方法之一。因此，CZE也被用于分析测定单唾液酸神经节苷脂［11］，具有高效、快速、供试品及试剂消耗少等优点。

3．3 有关物质

刘勤等［7］采用HPLC对GM1原料中有关物质进行了研究。考察了C18柱和NH2柱的分离效果，结果表明只有NH2柱，采用了梯度洗脱方法能将GM1及各有关物质完全分离。该法灵敏度较高，精密度好，专属性强，是作为GM1有关物质及降解产物检查的可靠方法。

王华等［9］为了查找采用不同工艺生产的成品中造成临床副反应的可能杂质，在反相C18柱基础上，进一步优化条件，分离了GM1药物的冻干粉、中间体和注射液，并对杂质进行了半制备级收集，用串联质谱对杂质的结构进行了鉴定。该法可用于鉴定GM1药物中引起临床不良反应的微量杂质。

4 结语

随着GM1试行质量标准的转正统一和提高，对GM1质量控制的要求也将越来越高。HPLC由于准确度高、重复性好的特点，在GM1含量测定和有关物质检查方面具有很大的优势。LC-MS由于可以提供更多的结构信息，对于企业在GM1生产工艺改进研究、稳定性考察和临床不良反应研究方面更有优势。

GM1的原料来源于动物脏器，提取工艺中又使用了大量的有机溶剂，高分子物质可能是引起过敏等不良反应，因此，GM1注射剂中的高分子物质和残留溶剂的控制是产品质量控制的关键点，也是探讨临床不良反应的新思路。笔者实验室正从事GM1注射剂的评价性抽验工作，对国内GM1注射剂的质量状况进行探索性研究。

［1］ 王海龙，孙润广，张 静，等．神经节苷脂的红外、紫外光谱分析及其多聚体结构的原子力显微镜观测［J］．光谱学与光谱分析，2009，29(4);1045-1049．

［2］ 徐桂芸，常理文．神经节苷脂的高效液相色谱-化学衍生方法进展［J］．色谱，1995，13(1):26-29．

［3］ 孙丽华，李 赟，王 茵．神经节苷脂的柱前衍生-反相高效液相色谱测定研究［J］．中国卫生检验杂志，2009，19(10):2211-2212．

［4］ 郑永彪，范慧红，徐康森，等．离子对高效液相色谱法分离测定单唾液酸神经节苷脂的含量［J］．药物分析杂志，2004，24(2):135-136．

［5］ 刘 勤，谢剑炜．单唾液酸四己糖神经节苷脂钠杂质检查及含量测定方法的研究［J］．药物分析杂志，2005，25(2):153-156．

［6］ 尕 瑞，郑永彪．高效液相色谱法分离测定神经节苷脂GM1中唾液酸的含量［J］．青海医药杂志，2009，39(3):49-50．

［7］ 刘 勤，谢剑炜．单唾液酸四己糖神经节苷脂钠注射液含量测定方法研究［J］．中国新药杂志，2003，12(12):1024-1026．

［8］ 张小宁．高效液相层析测定单唾液酸四己糖神经节苷脂钠含量方法的研究［J］．内蒙古医学院学报，2007，29(6):411-415．

［9］ 王 华，徐 媛，梁 锋，等．高效液相色谱-串联质谱法分离鉴定单唾液酸四己糖神经节苷脂中的杂质［J］．色谱，2009，27(1):29-33．

［10］金一宝，栗 晖，于治国，等．液质联用法测定奶粉中单唾液酸四己糖神经节苷脂(GM1)的含量［J］．沈阳药科大学学报，2010，27(2):126-130．

［11］郑永彪，范慧红，丁春玲，等．毛细管区带电泳法测定单唾液酸神经节苷脂 GM1的含量［J］．中国生化药物杂志，2004，25(3):139-141．

Research advances of quality control of monosialotetrahexosylganglioside sodium

REN Li-ping1，MENG Jiang-jiang2，GAO Zhi-feng1，FAN Hui-hong1
(1．National Institute for Food and Drug Control，Beijing 100050，China;2．East China University of Science and Technology，Shanghai 200237，China)

TQ460．72

A

1005-1678(2012)06-0925-02

2012-08-30

卫生部2009年卫生公益行业科研专项(子项目编号:200902008-5)

任丽萍，女，硕士，助理研究员，研究方向:生化药品质量分析;范慧红，女，通信作者，博士，研究员，研究方向:生化药品质量分析，Tel:010-67095349，E-mail:fanhuihong106@yahoo．com．cn。