脂肪来源干细胞在移植脂肪中的分化及其相关miRNA的表达

袁志坚，周 红，何晓升，何文涓

(1．无锡卫生高等职业技术学校，江苏 无锡 214028;2．杭州师范大学 临床医学院，浙江 杭州 310016)

脂肪来源干细胞在移植脂肪中的分化及其相关miRNA的表达

袁志坚1，周 红1，何晓升2，何文涓1

(1．无锡卫生高等职业技术学校，江苏 无锡 214028;2．杭州师范大学 临床医学院，浙江 杭州 310016)

本文介绍脂肪来源干细胞(ADSCs)在移植脂肪中经信号通路传递信号来调控ADSCs分化中转入因子的活性，及其分化中miRNA的表达，阐明ADSCs成脂分化中的作用机制，另外，从ADSCs成脂分化中脂肪细胞的形态变化观察其组织学特点及对几种检测手段的简单介绍。

脂肪来源干细胞;成脂分化;转录因子;信号通路;miRNA

脂肪来源干细胞(ADSCs)来源丰富，可进行自体移植，无免疫排斥反应之虑，其低免疫源性使其可行同种异体移植甚至异体异种移植，这更加拓宽了其应用范围，而且取材简便，有些是临床治疗后的副产品。ADSCs增殖能力非常强，据报道传至第10代仍具较强向脂肪细胞定向分化的能力［1］。在整形外科中，ADSCs的移植可应用于如皱纹的填充，痤疮瘢痕凹陷的填充，皮脂腺囊肿切除后局部皮下组织的缺损的填充，乳腺癌切除后乳腺的重建等［2］。脂向分化是一个包括激素刺激、信号转导、基因表达改变和细胞形态学改变的复杂过程。多种转录因子形成的网络状的系统参与到整个脂向分化的过程中，miRNA是基因表达的一种重要的转录后调控因子，所以miRNA可能通过某些途径调节成脂相关的转录因子参与到成脂分化的过程中，本文就ADSCs在移植脂肪过程中的分化及其miRNA的表达进行综述。

1 ADSCs的移植

ADSCs具有来源丰富、应用范围广泛、成本低、无瘢痕、可调整等优点，易于患者接受，在美容外科有广阔的应用前景。但是，单独的颗粒脂肪移植有钙化、囊肿形成、新生乳房肿瘤难以辨识等并发症的可能，为克服常规注射脂肪移植的问题，目前引起最多关注的是ADSCs辅助移植法。Matsumoto等［3-4］将所取的颗粒脂肪分成两部分:一部分用于提取ADSCs，一部分用于脂肪移植，提取后混合两部分共同移植于小鼠皮下，使用ADSCs辅助移植的脂肪体积大于未使用脂肪移植组35%，使用ADSCs辅助移植的脂肪在 Dil染色下血管内皮细胞较未使用脂肪移植组高，而且研究也证实ADSCs可以分化成脂肪细胞并促进脂肪再生，又可以分化成血管内皮细胞和壁细胞，促进血管化作用，为脂肪细胞提供营养，并分泌血管内皮生长因子(VEGF)和胰岛素样生长因子-1(IGF-1)等生长因子，防止脂肪细胞凋亡，因此可以说，ADSCs是维持脂肪移植成活的关键因素［5-6］。

2 ADSCs在移植脂肪中的分化情况

一般认为，ADSCs向脂肪分化经历从多能干细胞、脂肪母细胞、前脂肪细胞、不成熟脂肪细胞到成熟脂肪细胞的过程。目前，人们对多能干细胞向前脂肪细胞分化的这一阶段的研究较少，相比之下，前体脂肪细胞分化为成熟脂肪细胞的过程已经基本阐明。然而，了解了这一过程的作用机制对ADSCs成脂分化有重要的意义。

2．1 调控ADSCs向分化的转录调控

脂肪细胞从成纤维细胞样向圆形转变的这种形态学上显著的改变与细胞外基质成分的水平、类型及细胞支架构成的变化相平行。这些变化同样也引起一些重要转录因子表达的变化，例如 PPARγ、SREBP-1c、ADD-1 和 C/EBPs，对前体脂肪细胞向成熟脂肪细胞分化和基因表达模式的转变起了决定性的开启作用。

2．1．1 PPARγ PPARγ属于核受体超家族配体依赖的转录因子，是抗糖尿病药物噻唑烷二酮类的靶点。PPARγ的表达对于白色脂肪组织和棕色脂肪组织的形成都是必需的［7-8］。多能干细胞经PPARγ表达质粒转染可诱导脂肪细胞生成，促使3T3-L1前体脂肪细胞在无诱导剂存在的情况下，向终末脂肪细胞转化。PPARγ缺乏的小鼠可因胎盘缺陷而在胚胎期死亡，单纯去除PPARγ基因的ADSCs既不能分化为脂肪细胞，也不能参与脂肪组织的形成。

PPARγ由两种可选择的启动子转录并形成两种转录本，即PPARγ1和 PPARγ2。PPARγ2特异性表达于脂肪细胞中且随脂肪细胞分化表达上调，是脂肪细胞分化的决定性因子。应用重组逆转录病毒载体介导小鼠PPARγ2基因在NIH3T3成纤维细胞中表达，油红O染色证实，表达PPARγ2的NIHT3T3成纤维细胞在分化介质中培养分化10 d后，胞浆中明显积聚了较多的中性脂肪，其细胞形态也与体内成熟脂肪细胞相似，而且这些细胞表达脂肪细胞特异性标志基因。这些研究结果充分显示，PPARγ在脂肪细胞分化中发挥着关键的调节作用［9］。

2．1．2 SREBP-1c 类固醇调节原件蛋白(SREBP)，是近年来在肝脏中发现的一类能够调控不饱和脂肪酸的合成、葡萄糖的代谢以及胆固醇合成的转录调控因子。SREBP有三种亚型，即 SREBP-1a，SREBP-1c和 SREBP-2。其中，SREBP-1c在脂肪细胞中高表达，具有促进3T3-L1前体脂肪细胞分化的作用。另外有研究表明，SREBP-1c在脂肪细胞中促进甘油三酯的合成主要通过以下两种方式:①上调脂肪酸合成酶、乙酰辅酶A脱羧酶、硬脂酰辅酶A去饱和酶、磷酸烯醇丙酮酸羧激酶等基因表达促进甘油三酯合成;②转录激活PPARγ表达或通过诱导PPARγ配体表达而增加其生脂活性，促进 ADSCs分化［10］。

2．1．3 ADD-1 ADD-1是 SREBP家族的一种，能够与PPARγ基因的启动子结合，在脂肪组织中大量表达。因此，ADD-1也是调控脂肪细胞分化的重要转录因子。在前体脂肪细胞的分化过程中，ADD-1的表达升高，3T3-L1前体脂肪细胞中过度表达ADD-1/SREBP-1c可以诱导脂肪细胞特异性基因的表达。PPARγ本身可能就是ADD-1/SREBP-1c作用的一个靶基因，所以ADD-1发挥作用可能是通过调控PPARγ的表达和激活来进行的。

尽管目前ADD-1的表达调控及其调控脂肪细胞分化的作用机制尚未被完全阐明，但是大量的实验揭示其在胰岛素介导的脂肪细胞分化过程中发挥着重要的作用。

2．1．4 C/EBPs C/EBPs属于高度保守的亮氨酸锌指蛋白家族，包括α、β和δ三种亚型。C/EBPα的表达在 PPARγ之后，在脂肪细胞终末分化中发挥重要作用。此外，C/EBPα能够有效促进小鼠成纤维细胞向脂肪细胞分化。C/EBPα在细胞分化早期有抑制有丝分裂的作用，在启动细胞分化和保持脂肪细胞形态中有重要作用。敲除C/EBPα的小鼠体内不形成白色脂肪组织，表明C/EBPα在脂肪组织发育中起到关键作用。Lefterova等［11］最近研究揭示，PPARγ和 C/EBPα靶基因具有共区域化的特征。C/EBPβ和C/EBPδ是ADSCs分化早期的调控因子，主要能够通过诱导PPARγ和C/EBPα的表达而启动生脂信号，但随ADSCs分化其表达量逐渐减少。研究表明，C/EBPβ和C/EBPδ基因敲除鼠脂肪组织发育受损，而C/EBPβ和C/EBPδ基因缺失的ADSCs成脂分化能力也显著下降。

2．2 调控ADSCs脂向分化的信号通路

多种激素和生长因子在ADSCs分化过程中发挥着重要的作用。这些激素或生长因子在作用于脂肪细胞膜表面的特异受体后，经不同信号通路的信号传递，通过直接或间接的修饰调控ADSCs分化的转录因子活性，而实现对ADSCs分化的调控。主要的四条信号传导途径为:①MAPK途径;②胰岛素和IGF-1激活的酪氨酸激酶途径;③TGF-β/BMPs途径;④FGFs信号通路等。

2．2．1 MAPK 通路与 ADSCs分化 Auld 等［12］认为 MAPK通路可使多种核转录因子和蛋白激酶等多种底物磷酸化，从而调节相关基因的转录，参与细胞生长、发育及细胞间的功能同步等多种生理过程。由于ADSCs分化本身是一个多步骤、多调控因素的复杂过程，MAPK可能参与调控每个环节。因此，MAPK对其的调节也是复杂多样的，在不同阶段发挥不同的作用。

2．2．2 胰岛素/IGF-1信号转导与 ADSCs分化 胰岛素/IGF-1是最早被发现能够促进脂肪细胞分化的因子。由于脂肪细胞表面的胰岛素受体很少，大多是通过IGF-1受体激活的PI3K/Akt通路发挥其作用的。PI3K激活Akt/PKB后，GLUT1和GLUT4转位到细胞膜上，摄取葡萄糖，使脂肪细胞中甘油三酯合成增加，导致ADSCs分化［13］。

2．2．3 TGF-β/BMPs信号转导与 ADSCs分化 TGF-β 及其信号组分在体外培养的脂肪细胞和脂肪组织中均有表达。但是，TGF-β在体外培养条件下能抑制前体脂肪细胞的分化，超表达TGF-β会损害脂肪组织的发育。阻断内源性的TGF-β通路能促进脂肪形成。

BMPs对ADSCs的作用又依赖于BMP的类型和浓度，以及前体细胞的类型和其他调节物的参与。BMP2的功能更复杂并依赖于其他信号分子的参与。BMP4能使ADSCs定向为脂肪细胞谱系，并完成向脂肪细胞的分化。小鼠缺乏BMP2和BMP4都会在胚胎发育早期死亡，而这时脂肪细胞还没有开始发育，因此，BMP2和BMP4的作用还有待深入研究。但是，Jin等［14］的研究表明，BMP信号通路的中间物Schnurri2(SHN2)在体内和体外都是成脂分化所必须的，其功能是作为连接Smad1，Smad4和C/EBPα与PPARγ启动子的支架。

2．2．4 FGFs信号与 ADSCs分化 最近的研究表明，FGFs在脂肪形成中发挥着积极的作用。FGF1是微血管内皮细胞释放的一种物质，它在人前体脂肪细胞中具有促成脂活性。FGF2植入小鼠子宫，甚至耳软骨或肌肉中都能诱导脂肪组织的发育。FGF10在白色脂肪组织的间质脉管细胞中表达，也在3T3-L1细胞脂肪形成的早期表达。

2．3 ADSCs在成脂分化过程中细胞的组织学特点及其相关检测

ADSCs经成脂诱导3 d后，倒置显微镜观察细胞体积增大，由梭形变为圆形或多角形，最为显著的改变是细胞呈多极突起，且突起细长，而且位于核周的小部分细胞质内开始出现很小的折光性很强的脂滴。诱导后7 d，部分细胞脂滴增多，有的脂滴聚集成较大的脂泡，脂肪细胞呈灶状分布。诱导后14 d，绝大部分细胞已变成脂肪细胞，细胞多呈圆形或椭圆形，细胞质内可见大量脂滴［15］。油红 O染色可见脂滴被染成红色，呈强阳性［16］。对照组仅有极少数细胞出现脂滴聚集，大多细胞油红O染色呈阴性。此外，也可以抽取诱导7～10 d的脂肪细胞的总RNA，RT-PCR检测脂肪细胞的特异性基因PPARγ的表达，利用图像分析软件分析PCR产物/β-actin灰度比值［17］。当然还有其他检测方法可以证实ADSCs的成脂分化，如定位荧光标记细胞，伊红染色等。

3 ADSCs脂向分化过程中miRNA的表达

脂肪细胞分化过程受到大量miRNA影响，其中一些miRNA能够显著地调节脂肪细胞的分化，如miR-16、miR-17-92、miR-21、miR-27a、miR-27b、和 miRNA-134 等。

3．1 miR-16

miR-16是miRNAs中的一员，其作用十分广泛。Wang等［18］认为miR-16等microRNA的表达变化可以控制细胞的生长速度;Calin等［19］认为miR-16通过BCL2(细胞凋亡调节子)调控细胞凋亡，miR-16还参与调控细胞因子的RNA的不稳定性。结果显示miR-16在脂肪基质细胞脂向分化过程中表达显著下调，所以推测miR-16可能通过调控PPARγ、SREBP-1c、ADD1和C/EBPs等在脂肪基质细胞脂向分化过程中重要的转录因子中的一种或几种，从而在ADSCs脂向分化过程发挥作用［20］。

3．2 miR-17-92

Wang等［21］的研究表明，miR-17-92通过靶向 Rb2/p130的mRNA而促进前体脂肪细胞分化。前体脂肪细胞发生融合和生长抑制后，再在激素等的刺激下进入细胞周期，才开始分化。然而在此期间，转录因子E2F作用于细胞由G1期向S期的转化，而Rb2/p130与E2F的结合抑制了E2F功能的发挥进而抑制了细胞分化。miR-17-92能结合在Rb2/p130的RNA上，通过减少Rb2/p130的表达促进脂肪细胞的分化［22］。

3．3 miR-21

王伟新等［23］研究表明，miRNA-21的表达在 ADSCs脂向分化过程中显著下调，并经实时定量聚合酶链反应实验证实这一结果，提示 miRNA-21参与了 ADSCs的脂向分化过程，所以推测 miRNA-21可能通过 PPARγ、SREBP-1c、ADD1和C/EBPs等转录因子，在ADSCs的成脂分化中调控信号传导通路，实现其在ADSCs成脂方向的作用。

3．4 miR-27a和 miR-27b

肖金刚等［24］的研究显示，miR-27a和miR-27b在 ADSCs向脂肪细胞分化的过程中表达显著下调。miR-27a和miR-27b可调控个体的早期发育和细胞分化，通过作用于抗血管形成的基因而促进血管发生［25］。生物信息学分析表明PPARγ是miR-27a和 miR-27b的靶基因之一，PPARγ是脂肪细胞发育和脂肪形成过程中特异的核心转录调控因子，可促进脂肪细胞分化，所以miR-27a和miR-27b可能是通过调控PPARγ的表达进而促进ADSCs的脂向分化。

3．5 miR-134

miR-134作为miRNA家族中的成员之一，可以单独促进人类胚胎干细胞的分化。王黎等［26］研究证实，miR-134在ADSCs脂向分化过程中表达显著下调，原因可能是miR-134与抑制凋亡的基因 Bcl-2、Bcl-XL、Bcg-l、Tbx3(T-box3)等中的一种或几种翻译出的mRNA结合减少，降低或消除对这些基因的抑制，使抑制凋亡的基因发挥作用，参与MAPK、Insulin/IGF-1、TGFβ/BMPs和 FGFs等信号转导途径，为 ADSCs向脂肪细胞方向分化创造促进条件。

4 结语

ADSCs的成脂分化受各种miRNA的影响，经不同信号通路的信号传递，通过直接或间接的修饰调控ADSCs分化的转录因子活性，从而实现对ADSCs分化为成熟脂肪细胞并部分参与构成移植物脂肪的调控。另外，ADSCs在移植后的急性期处于缺氧的环境，可以以旁分泌的形式释放可溶性血管形成因子，促进移植物的新生血管形成，使得更多的脂肪组织更早的建立血运，获取营养，提高其存活率，所以，ADSCs辅助移植作为一种细胞疗法具有一定意义，但能否解决临床上ADSCs移植的根本问题，仍需进一步研究。

［1］ Boquest A C，Shahdadfar A，Fronsdal K，et al．Isolation and transcription profiling of purified uncultured human stromal stem cells:alteration of gene expression after in vitro cell culture［J］．Mol Biol Cell，2005，16(3):1131-1141．

［2］ 邓 颖，谢红炬．自体脂肪细胞注射移植研究进展［J］．现代医药卫生，2011，27(9):1351-1354．

［3］ Matsumoto D，Sato K，Gonda K，et al．Cell-assisted lipotransfer:supportive use of human adipose-derived cells for soft tissue augmentation with lipoinjection［J］．Tissue Eng，2006，12(12):3375-3382．

［4］ 杨 波，沈宏亮，徐志飞，等．脂肪组织来源干细胞可促进脂肪移植物的存活率［J］．中国组织工程研究，2012，16(19):3492-3495．

［5］ 杨懿爱，郑丹宁，李青峰．细胞移植在自体脂肪填充中的应用进展［J］．组织工程与重建外科杂志，2012，8(2):106-108．

［6］ 赵德梅，谭 谦．提高自体脂肪移植成活率的研究进展［J］．中国美容医学，2011，20(12):1985-1987．

［7］ Billon N，Monteiro M C，Dani C，et al．Developmental origin of adipocytes:new insights into a pending question［J］．Biol Cell，2008，100(10):563-575．

［8］ Enerback S．The origins of brown adipose tissue［J］．New Engl J Med，2009，360(19):2021-2023．

［9］ 李惠侠．Wnt/β-catenin信号通路在猪ADSCs向脂肪细胞分化中的作用及机理研究［D］．杨凌:西北农林科技大学，2008．

［10］鞠大鹏，詹丽杏．脂肪细胞分化及其调控的研究进展［J］．中国细胞生物学学报，2010，32(5):690-695．

［11］ Lefterova M I，Zhang Y，Steger D J，et al．PPAR gamma and C/EBP factors orches-trate adipocyte biology via adjacent binding on a genome-wide scale［J］．Gene Dev，2008，22(21):2941-2952．

［12］ Auld C A，Caccia C D，Morrison R F，et al．Hormonal induction of adipogenesis induces Skp2 expression through PI3K and MAPK pathways［J］．Cell Biochem，2007，100(1):204-216．

［13］ Yu W H，Chen Z G，Zhang J L，et al．Critical role of phosphoinositide 3-kinase cascade in adipo-genesis of human mesenchymal stem cells［J］．Mol Cel Biochem，2008，310(1-2):11-18．

［14］ Jin W，Takagi T，Kanesashi S N，et al．Schnurri-2 controls BMP-dependent adipo genesis via interaction with Smad proteins［J］．Dev Cell，2006，10(4):461-471．

［15］黄 宏，朱方强，孙宏振，等．脂肪来源干细胞体外成骨诱导和成脂诱导分化［J］．第三军医大学学报，2008，30(13):1219-1222．

［16］徐小春，李光早．脂肪来源干细胞的基础研究及成脂应用进展［J］．中华全科医学，2012，10(5):783-784．

［17］程文丹，赵 宇，何金生，等．大鼠脂肪干细胞体外定向诱导分化脂肪细胞和成骨细胞的研究［J］．安徽医科大学学报，2007，42(5):501-503．

［18］ Wang X，Tang S，Le S Y，et al．Aberrant expression of oncogenic and tumor-suppressive microRNAs in cervical cancer is required for cancer cell growth［J］．PLoS ONE，2008，3(7):2557．

［19］ Calin G A，Cimmino A，Fabbri M，et al．MiR-15a and miR-16-1 cluster functions in human leukemia［J］．Proc Natl Acad Sci USA，2008，105(13):5166-5171．

［20］李明恒，张 勇，李晓宇，等．microRNA-16在脂肪基质细胞脂向分化过程中的表达变化［J］．中国组织工程研究与临床康复，2009，13(2):221-223．

［21］ Wang Q，Li Y C，Wang J H，et al．miR-17-92 cluster accelerates adipocyte differentiation by negatively regulating tumor-suppressor Rb2/p130［J］．Proc Natl Acad Sci USA，2008，105(8):2889-2894．

［22］吴家昌，马 琼，邹贤飞，等．miRNA与细胞分化的研究进展［J］．现代生物医学进展，2010，10(3):567-569．

［23］王伟新，张 勇，李晓宇，等．脂肪基质细胞脂向分化过程中MicroRNA-21的表达变化［J］．现代生物医学进展，2009，9(23):4404-4406．

［24］肖金刚，陈建霖，李晓宇，等．脂肪干细胞脂向分化过程miRNA-27b表达的研究［J］．天津医药，2009，37(9):759-761．

［25］ Kuehbacher A，Urbich C，Zeiher A M，et al．Role of dicer and drosha for endothelial microRNA expression and angiogenesis［J］．Circ Res，2007，101(1):59-68．

［26］王 黎，张 勇，李晓宇，等．脂肪基质细胞脂向分化过程MicroRNA-134 的表达变化［J］．广东医学，2009，30(4):503-506．

Differentiation and miRNA expressiom of adipose-derived stem cells in fat transplantation

YUAN Zhi-jian1，ZHOU Hong1，HE Xiao-sheng2，HE Wen-juan1
(1．Wuxi Higher Health Vocational Technical School，Wuxi 214028，China;2．School of Clinical Medicine，Hangzhou Normal University，Hangzhou 310016，Chian)

Q813

A

1005-1678(2012)06-0924-04

2012-06-21

江苏省卫生厅卫生科研项目(编号:J201117)

袁志坚，男，副教授，E-mail:yzj0126@yahoo．com．cn;何晓升，男，通信作者，E-mail:hexs@163．com。