安徽省仔猪腹泻5种病毒感染情况的调查研究

秦谷雨，杨 勇，李 郁，魏建忠，孙 裴，＊

（1.安徽农业大学动物科技学院，安徽合肥230036；2.安徽安泰农业集团，安徽合肥230036）

猪流行性腹泻病毒（Porcine epidemic diarrhea virus，PEDV）、猪传染性胃肠炎病毒（Porcine transmissible gastroenteritis virus，TGEV）、轮状病毒（Rotavirus，RV）、猪伪狂犬病病毒（Pseudotabie，PRV）、猪圆环病毒2型（Porcine circovirus-2，PCV-2）的单独或混合感染是引起仔猪病毒性腹泻的重要病因［1-3］。各种年龄的猪均对这5种病毒易感，尤其是哺乳仔猪感染率与病死率都很高［4-5］。2010年冬季以来，新生仔猪病毒性腹泻在我国乃至东南亚多个养猪国家呈现高发病率、高死亡率的流行态势，死亡仔猪超过100万头，造成巨大的经济损失［8-9］。目前，我国南方数省（广西、广东、福建、甘肃等省）对其病因的研究表明，病原主要是PEDV的变异株，与韩国2011年流行株的同源性最高［5-7］。但是不同地区有其相应区域性，尚未有研究在安徽省地区造成仔猪病毒性腹泻的病因。本试验旨在探索出安徽省致使仔猪腹泻流行的病毒性病因，为制定适宜安徽省防控仔猪腹泻的措施提供依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 病料 2011年10月～2012年5月，从安徽地区37个规模化猪场采集腹泻仔猪的粪便或病死猪肠段共计186份（表1），仔猪日龄范围为1日龄～60日龄，其中1日龄～10日龄仔猪120例，11日龄～15日龄仔猪35例，30日龄～60日龄仔猪31例；病料在-80℃保存。PEDV、TGEV、PDV阳性病料由华中农业大学何启盖教授惠赠，PRV和PCV-2阳性毒株由安徽农业大学动物传染病实验室分离、鉴定与保存。

1.1.2 主要试剂 RNAsimple Total RNA kit为OMEGA公司产品；Quant One Step RT-PCR Kit为天根生化科技（北京）有限公司产品；RNA反转录酶、RNA 酶抑制剂、Taq DNA 聚合酶、dNTPs、DNA Marker DL 2000、DNA Marker DL 600等均为宝生物工程（大连）有限公司产品。

1.2 方法

1.2.1 引物设计与合成 参考文献［2，11］以及根据GenBank中已经登录的PEDV、TGEV、PDV、PRV、和PCV-2核酸序列进行引物设计，引物由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。P1／P2为PEDV检测引物，扩增片段大小为213bp；P3／P4为TGEV检测引物，扩增片段大小为546bp；P5／P6为PDV检测引物，扩增片段大小为309bp；P7／P8为PRV检测引物，扩增片段大小为217bp；P9／P10为PRV-2检测引物，扩增片段大小为630bp（表2）。1.2.2 病料处理 按照文献［12］，取2cm～3cm的肠段或5g仔猪腹泻粪便，用灭菌的玻璃匀浆器进行研磨，用pH7.4的Hanks液做10倍稀释，反复冻融2次～3次，3 000r／min离心10min；取上清液；4℃、12 000r／min离心5min；收集上清液于-80℃保存备用。

表1 187份病料来源Table 1 Sources of collected 187diseased materials

表2 5种病毒PCR及RT-PCR特异性检测引物序列及扩增片段大小Table 2 Sequences and sizes of used for PCR（RT-PCR）amplification of 5kinds of viruses

1.2.3 DNA的提取及PRV／PCV-2的检测 取250μL上述病料上清液加400μL消化液，55℃水浴，消化4h～5h；12 000r／min离心10min；取400 μL上清液，加200μL Tris饱和酚，200μL氯仿，翻转均匀，12 000r／min离心10min，取上清400μL，加800μL冰冻乙醇，置-20℃沉淀30min，12 000 r／min离心5min，4℃，弃液，再加500μL 700 mL／L乙醇洗涤，弃去干燥，加ddH2O 30μL～50 μL溶解，置-20℃保存备用。PRV的PCR扩增条件为：PCR反应体系为25μL，含有Gc-mix 12.5μL（TaqE＋dNTP），去离子水5.5μL，上引物 P5 1μL，下引物P6 1μL，DNA模板5μL。PCR反应条件为：94℃3min；94℃1min，65℃1min，72℃1min，40个循环；72℃7min。设PRV细胞毒作为阳性对照，PRV阴性病料作为阴性对照。PCV-2的PCR扩增条件为：根据参考文献［13-14］进行PCR操作，PCR反应体系为25μL，其中DNA模板（1pmol／μL）5μL，Mix（TaqE＋dNTP）13μL，去离子水5μL，上引物P9 1μL，下引物P10 1μL；PCR反应条件为：95℃10min；95℃1min，72℃40s，49℃50s，35个循环；72℃10min。设PCV-2细胞毒作为阳性对照，PCV-2阴性病料作为阴性对照。1.2.4 RNA的提取及PEDV、TGEV和PDV的检测 按照RNA Simple Total RNA Kit试剂盒说明书提取病料总RNA。按照Quant One Step RTPCR Kit说明书，分别进行PEDV、TGEV和PDV的检测。Quant One Step RT-PCR反应体系与操作方法为：反应总体系50μL，冰上操作，预加入30.5μL的Quant One Step RT-PCR反应混合液，再加入1μg～10ng总RNA模版，分别加上、下游引物（浓度为10μmol／L）各3μL，补 RNase-free ddH2O至50μL。根据参考文献［11-12］，PEDV、TGEV的PCR反应条件为：95℃5min；94℃30s，51℃30s，72℃45s，35个循环；72℃10min；PDV的PCR反应条件为：94℃4min；94℃45s，50℃45 s，72℃ 45s，30个循环；72℃ 7min。设 PEDV、TGEV和PDV细胞毒作为阳性对照，未接毒细胞作为阴性对照。

2 结果

2.1 PCR扩增产物

琼脂糖凝胶电泳显示，5种病毒阳性病料PCR扩增产物大小与预期片段大小一致，如PEDV阳性病料扩增到大小为213bp的片段；TGEV阳性病料扩增到大小为546bp的片段；PDV阳性病料扩增到大小为309bp的片段；PRV阳性病料扩增到大小为217bp的片段；PRV-2阳性病料扩增到大小为630bp片段。5种病毒阴性对照均未扩增到目的片段（图1）。结果表明，所设计的引物能作为相应病毒的检测。

图1 5种病毒PCR检测结果Fig.1 PCR results of five viruses

2.2 病料中5种病原检测结果

对186份病料进行5种病原PCR检测结果显示，PEDV阳性病料数为110例（占59.1%），阳性猪场28个（占75.7%）；TGEV阳性病料数为10例（占5.4%），阳性猪场3个（占8.1%）；RV阳性病料数为5例（占2.7%），阳性猪场1个（占2.7%）；PRV阳性病料数为15例（占8.1%），阳性猪场8个（占21.6%）；PCV-2阳性病料数为48例（占25.8%），阳性猪场20个（占54.1%）。

PEDV与TGEV混合感染阳性病料数为8例（占4.3%），PEDV与PCV-2混合感染阳性病料数为35例（占18.8%），PEDV与PRV混合感染阳性病料数为20例（占10.8%），PRV和PCV-2阳性病料数为9例（占4.8%），其他病因50例（占26.9%）。

安徽地区2011年10月～2012年5月期间37个规模化猪场仔猪病毒性腹泻病原中，PEDV感染率最高，阳性率可达59.1%，是导致仔猪腹泻的主要病因；其次PCV-2和或PRV单一感染和或PEDV的混合感染，也是造成该地区仔猪腹泻的重 要原因。

图2 5种病毒单一或混合感染率Fig.2 Single or mixed infection rates of five viruses

3 讨论

2011年何启盖［15］报道了华中地区57个猪场的855份样品的检测结果显示，其中33个猪场为PEDV感染，阳性场占58%，PCV-2阳性场占46%，RV阳性场占22%，TGEV阳性场占14%。本研究结果显示，PEDV阳性猪场占75.7%，PCV-2阳性猪场占54.1%，PEDV与PCV-2混合感染阳性占18.8%、PEDV与PRV混合感染阳性数占10.8%，结果表明安徽地区PEDV的感染是近2年仔猪腹泻的重要传染性病因。PCV-2、PRV和或PEDV单一或混合感染也是猪群腹泻的重要病因。

比较已有报道［1，8，10，12］，本研究结果提示，安徽省猪流行性腹泻的流行病学发生了新特点：①流行范围广，几乎遍布了安徽省各个地区。②免疫接种猪仍发病。本文受检37个猪场中有50%以上每年9月份免疫减毒或灭活腹泻三联苗（PEDV＋TGEV＋RV）或二联苗（PEDV＋TGEV），然而腹泻疫情仍有发生。③季节性变得不明显。不仅在冬季流行情况严重，时间上也一直蔓延到了今年的春末（4月和5月份仍有发生）。有报道［16］其他省区夏季高温时期仍有出现流行性腹泻。④高发于哺乳仔猪。187份病料中，1日龄～10日龄仔猪120例，11日龄～15日龄仔猪35例，30日龄～60日龄仔猪31例，哺乳仔猪发病数占82.9%，症状也最严重。患病仔猪表现水样腹泻，或伴随呕吐，呕吐多发生于吃食或吮乳之后。粪便如水，呈灰黄色或灰色［17-18］。仔猪消瘦，皮肤呈油腻状，常于腹泻后2d～4d内因脱水而死亡，病死率最高达100%。

综合研究结果，PEDV、PCV-2、PRV的单纯或混合性感染是近年安徽省仔猪腹泻的最为重要的三大病毒性疾病，结果提示在今后的猪腹泻病防控过程中应该着重加强该3种疾病的综合防控，同时本研究所设计的5种病原PCR引物也为该5种病原的快速诊断提供了技术基础。

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