淋巴瘤患者循环microRNA－21的检测及其临床意义＊

陈卫群，孔德勇，王 卉，刘水逸，孔庆志，卢忠心△

（武汉市中心医院:1.检验科；2.中心实验室 430014）

microRNA（miRNA）是近年来发现的一类长度约22个核苷酸非编码小分子RNA，通过靶mRNA降解或抑制其翻译来调节靶基因的表达，在细胞的分化、增殖和凋亡，个体发育、机体代谢，以及肿瘤、病毒感染等多种疾病中都具有重要的作用。研究表明，miRNA作为癌基因或抑癌基因，广泛参与肿瘤的发生发展过程；不同肿瘤组织miRNA表达谱不同。最新研究发现，肿瘤患者血清中存在肿瘤细胞特异性miRNA，并且高度稳定，表明肿瘤患者血清中miRNA的表达可能成为新的肿瘤标志物。本研究通过检测淋巴瘤患者外周血中循环miR－21的表达，为淋巴瘤的早期诊断提供可靠的理论和实验依据。

1 材料与方法

1.1 材料 收集60例临床确诊的淋巴瘤患者外周血，50名健康体检人群外周血作为正常对照组。选择临床确诊的淋巴瘤患者30例，同时收集肿瘤活检组织和外周血。肿瘤组织和血清中miRNA的提取采用miRNA提取试剂盒（mirVanaTMmiRNA Isolation Kit，美国 Ambion公司），microRNA－21（miR－21）检测采用TaqMan miRNA分析试剂盒（美国ABI公司）。

1.2 方法 采用FQ－PCR检测miR－21的表达水平，用miRNA提取试剂盒提取肿瘤组织和血清中的miRNA，用miR－21检测试剂盒检测miR－21的表达水平。首先取10ng总RNA与3μL逆转录酶混合，在15μL反应体系中，16℃30min、42℃30min、85℃5min进行逆转录；然后将逆转录产物cDNA 150倍稀释，取2μL稀释的cDNA与2μL TaqMan引物混合，在20μL反应体系中，95℃10min变性，随后95℃15s，60℃60s，40个循环。相对miRNA表达水平用2△△Ct计算改变倍数，U6snRNA作为内对照。

1.3 统计学处理 采用SPSS 13.0软件进行统计学分析，计量资料采用表示。各指标间的比较采用t检验，P＜0.05为差异具有统计学意义。

2 结 果

2.1 两组患者外周血中循环miR－21的表达结果 与正常对照组比较，淋巴瘤患者外周血中循环miR－21显著升高（t＝6.9，P＜0.0001），结果见图1。

2.2 淋巴瘤患者外周血循环中miR－21与对应肿瘤组织中的miR－21的相关性分析结果 结果显示淋巴瘤患者外周血中循环miR－21的表达与对应肿瘤组织中mir－21的表达显著相关（r2＝0.931，P＜0.0001），见图2。

图1 两组患者血清中miR－21的表达

图2 淋巴瘤患者外周血中循环miR－21的表达与对应肿瘤组织中miR－21的表达相关性

3 讨 论

miRNA是近年来发现的一类长度约22个核苷酸非编码小分子RNA，通过降解靶mRNA或抑制其翻译来调节靶基因的表达，在细胞的分化、增殖和凋亡，个体发育、机体代谢，以及肿瘤、病毒感染等多种疾病中都具有重要的作用，是当前的研究热点和前沿之一［1－2］。目前已发现700多种人类miRNA，由于miRNA通过与靶序列的不完全互补来调节基因的表达，一个miRNA可以调节多个基因的表达，同时一个基因可以被多个miRNA所调节，所以miRNA被认为是最重要的调节分子之一，大约92%的人类基因被miRNA所调节［3］。目前国外对miRNA的研究进展很快，随着对miRNA的产生机制、调节基因表达的分子机制研究不断深入，miRNA的检测方法的不断完善，miRNA作为诊断的分子标志和治疗及预后判断的分子靶点也进入临床前研究。国内目前主要集中于对单个疾病的miRNA表达谱的研究，机制研究很少，检测方法不够成熟并且比较单一。

miRNA与肿瘤密切相关，约52%的miRNA编码基因位于肿瘤相关基因位点和脆性染色体区域［4］；在肿瘤中miRNA异常表达且具有组织特异性，不同肿瘤组织miRNA表达谱不同［5］；进一步研究表明miRNA作为癌基因或抑癌基因，广泛参与肿瘤的发生发展过程［6］。miRNA可能成为肿瘤诊断的新的分子标志物和治疗及预后判断的分子靶点，由于miRNA在转录后水平调节基因的表达，因此更有利于肿瘤的早发现、早诊断和早治疗，必将具有广泛的临床应用前景［7］。

最新研究发现，肿瘤患者血清中存在肿瘤细胞特异性miRNA，并且高度稳定，能够抵抗血清中以及外源性RNase［8－10］。由于血清标本易于获得且容易被患者所接受，检测肿瘤患者血清中miRNA的表达，将成为肿瘤诊断、治疗以及预后判断的有利工具。但至目前为止进行肿瘤患者血清中miRNA表达检测研究的病例数非常有限，并且尚未见应用肿瘤患者血清中miRNA的表达进行肿瘤分级分期和预后判断的研究。因此扩大病例数并利用进行肿瘤患者血清中miRNA的表达进行肿瘤分级分期和预后判断的研究将具有重要的理论和应用价值。

miR－21是目前发现的惟一在多种实体肿瘤（肺癌、胃癌、肝癌、乳腺癌、前列腺癌、胰腺癌、结肠癌、头颈部肿瘤、食管癌等）及非实体瘤（慢性淋巴细胞性白血病、B细胞性淋巴瘤等）中高表达的miRNA［11－13］，也是第一个在肿瘤患者血清中检测到的miRNA。作者的前期研究表明，miR－21通过靶向细胞凋亡相关基因（programmed cell death 4，PDCD4）而促进肿瘤细胞增殖，参与肿瘤的发生发展；应用反义 miR－21（anti－miR－21）抑制miR－21的表达能够抑制肿瘤细胞的增殖，诱导肿瘤细胞凋亡［14］，被认为是重要的癌基因之一。

淋巴瘤是原发于淋巴结或淋巴结外组织或器官的一种恶性肿瘤，根据临床和病理特点不同，淋巴瘤分为霍奇金病（hodgkin disease，HD）和非霍奇金淋巴瘤（non－hodgkin lymphoma，NHL）。淋巴瘤的诊断主要依靠临床表现、病理学检查及必要的辅助性检查，对只有深部病变而无浅表淋巴结肿大者，诊断往往较困难。近年来淋巴瘤发病率呈不断增加趋势，寻找有效地、无创或微创的早期诊断标志对于淋巴瘤的防治具有重要意义。研究表明淋巴瘤肿瘤组织中miR－21高表达［15］，表明miR－21可能成为淋巴瘤早期诊断的重要标志之一。作者的研究结果显示，在淋巴瘤患者外周血中循环miR－21表达水平高于正常对照组水平，且与淋巴瘤患者肿瘤组织中miR－21的表达密切相关，循环miR－21的检测可能成为淋巴瘤新的早期诊断的分子标志。血清miR－21作为淋巴瘤诊断和预后分子标志物不仅具有创伤小，方法准确、便捷的优势，而且还可改进淋巴瘤诊断、分类、预后估计、疗效及复发预测的精度。但是，由于miR－21在多种肿瘤中高表达，仅仅检测血清miR－21作为肿瘤标志物特异性不足，若将多种miRNA组合使用并与其他类型肿瘤标志物检测相结合，可望显著提高诊断的准确性。血清miRNA作为新兴的肿瘤分子标志物在未来的肿瘤临床诊断和治疗中会有更好的应用前景。

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