灵芪胶囊对S180荷瘤小鼠组织形态学改变的影响

李环，苏云明

(黑龙江中医药大学，黑龙江 哈尔滨 150040)

肺癌是严重危害人类健康的疾病之一，具有高死亡率，高致残率的特点。目前肺癌的治疗并未取得理想的效果。而中药及复方有效地补充了常规治疗的缺陷［1－2］。灵芪胶囊是一种中药复方制剂，具有很好的抗癌作用。

1 实验材料

1.1 实验动物

昆明种小鼠，由黑龙江省药物安全性评价中心提供，符合实验要求，体质量(22±2)g，雌雄各半，合格证号:黑动字第P00101006号。

1.2 实验瘤株

小鼠实体型移植肉瘤180(S180)，由哈尔滨医科大学第三附属医院肿瘤研究所提供。

1.3 药物

灵芪胶囊(灵芝、黄芪、绵马贯众、重楼、山慈菇、人参、山药、枸杞、五味子、茯苓组成，由黑龙江中医药大学药理教研室提供。每粒胶囊含生药约1.65g，实验时临时配制成溶液);复方环磷酰胺片(天津金世制药有限公司，国药准字H12021006)。

1.4 主要实验仪器

超净工作台;电子天平;真彩色病理图像分析系统;微量加样器;轮转式组织切片机等。

2 实验方法

2.1 实验分组及给药

造模成功之后，将实验动物随机分为6组，每组10只，实验分组及其给药剂量如下:灵芪胶囊高剂量组(5.00g/kg)，灵芪胶囊中剂量组(2.50g/kg)，灵芪胶囊低剂量组(1.25g/kg)，灵芪胶囊中剂量+复方环磷酰胺组，模型对照组(同等容积0.9%Nacl)，阳性对照组给予复方环磷酰胺片(39mg/kg)。于接种瘤株24h后分组，为灌胃给药，给药时间为连续21天。

2.2 电镜观察瘤组织的组织形态学

超净操作台内抽取传代7f、生长状态良好的S180荷瘤小鼠的腹腔积液，在冰盘上进行操作，以无菌生理盐水按照1∶3的比例进行稀释，按体积0.2ml/只接种实验动物右前肢腋部皮下，注射前先行常规消毒。24h后给药，给药时间为连续11天，停药后，第二天称取小鼠体重，然后处死实验动物，手术取出取瘤块，进行固定。

取材与固定:将正常生长的瘤块打碎成为组织匀浆液，用PBS缓冲液洗涤3次，最后一次将细胞转移到1.5ml的 EP管中，在低温高速离心机中离心，12 000rpm，－4℃，5min，去除上清液，立即转入固定液(2%戊二醛液均可)pH值7.2，4℃固定时间约4h。

倒掉固定液，用0.1M，pH值7.0的磷酸缓冲液漂洗样品3次，每次15min;用1%的锇酸溶液固定样品1～2h;倒掉固定液，用0.1M，pH值7.0的磷酸缓冲液漂洗样品3次，每次15min;应彻底漂洗干净，减少固定液与固定液或与脱水剂之间的反应。

丙酮梯度脱水:脱水是将组织中的游离水彻底清除的过程。由于常用的包埋剂大都是非水溶性树脂，只有将生物组织中的游离水清除干净，包埋剂才能浸入组织。丙酮梯度脱水浓度配比见表1。

表1 丙酮梯度脱水浓度配比

脱水过程中应注意:逐级脱水而不能急剧脱水;更换溶液时动作要快，特别是不要让组织离开溶液，否则会在组织内外产生气泡;脱水过程中若要长时间停留或过夜，应放在70%脱水剂中，并在4℃保存。

包埋与渗透:渗透就是用包埋剂逐渐取代组织中的脱水剂，使细胞内外空隙被包埋剂所填充。包埋剂通常由树脂、硬化剂、增塑剂及催化剂4种试剂按一定比例配制而成。

把细胞块放入包埋模具的顶端，再放入实验标签，然后加入包埋剂。包埋剂配制及使用过程中的注意事项:所有容器及玻璃棒等应是清洁和干燥的;配制过程中应搅拌均匀，使用过程中应避免异物，特别是水、乙醇、丙酮等混入包埋剂;配制好的包埋剂应密封保存，避免受潮。剩余包埋剂可密封并储存在－10℃ ～－20℃冰箱中，延长其使用期。

聚合:37℃烘箱内过夜，45℃烘箱内12h，60℃烘箱内24h。

标本的修整:将细胞块从温箱中取出，用修块机修整，曝露细胞，在用修块机或刀把曝露出的细胞团修整成45°角立体梯形。

半薄切片的制备:把包埋后修整好的细胞团，切成厚度 0.5 ～1.0μm，最大切片面积 2mm2，目的是补充光镜下所观察的内容，定位制备超薄切片。

超薄切片的定位:超薄切片的面积为0.55mm2，因此在进行超薄切片前必须将细胞团细切，尽量保留所要观察的部位，但保留的部位不能太大，否则影响切片质量。

载网:将切片附在金属载网膜面上。

2.3 醋酸铀－枸橼酸铅双染色 电子染色法是利用重金属于细胞的密歇成分结合或吸附，在电子束的照射下，样品形成不同的散射能力，而提高了图像的反差。

3 结果 见图1。

图1 电镜观察瘤组织的组织形态学图片(11 500×)

空白对照组:细胞多呈现圆形，表面有大小不等的突起和长短不一的绒毛，核形不规则，核仁清晰。胞浆双层膜结构清晰，可见线粒体，粗面内质网，游离核糖体。核膜轻度生理性皱缩，细胞表面可见微绒毛和较大突起。

灵芪胶囊高剂量组:部分细胞胞浆空泡变性，部分细胞固缩坏死。胞浆内可见大小不等的空泡状结构，线粒体髓样变性，粗面内质网明显减少，双层膜结构不清晰。粗面内质网脱颗粒。细胞膜破损，细胞核肿胀，异染色质边集，线粒体空泡变性，大部分线粒体肿胀。细胞器结构模糊，核膜不清晰，细胞膜破损。

灵芪胶囊中剂量组:大部分细胞崩解坏死，异染色质边集，细胞体成凋零状。胞浆内可见大量的自噬体，细胞膜不清晰，内质网，游离核糖体明显减少。部分线粒体肿胀，部分线粒体嵴融合，粗面内质网脱颗粒，游离核糖体减少。细胞器结构模糊。细胞形态不规则，细胞突起明显减少，细胞膜不完整，细胞器膜性结构融合。部分细胞细胞器结构消失，胞浆内残存少量游离核糖体。

灵芪胶囊低剂量组:细胞膜，核膜清晰，突起，微绒毛明显减少。粗面内质网扩张，脱颗粒，可见自噬体。核膜结构清晰，线粒体明显肿胀，核糖体减少。

阳性对照组:部分细胞崩解坏死，部分细胞核异染色质边集，核膜结构不清。核膜结构清晰，可见线粒体结构完整，粗面内质网，游离核糖体。双层膜结构清晰，线粒体丰富，有大量粗面内质网，游离核糖体。细胞多呈圆形，核膜曲度变大，核仁清晰。核膜结构清晰，线粒体膜完整，线粒体结构尚正常。自噬体，为用药导致细胞器损伤。部分细胞浆内可见大小不等的空泡。核膜双层膜结构消失融合，线粒体空泡变性，部分细胞凋零样变性。

4 结论

细胞形态学观察显示，灵芪胶囊可促进肿瘤细胞的凋亡及坏死，并引发相应的炎细胞反应。

［1］王重洋，关欣，宋武元，等.艾迪注射液联合化疗治疗晚期非小细胞肺癌临床观察［J］.中医药学报，2011，39(2):43 －44.

［2］杨静.浅谈肺癌从脾胃论治［J］.中医药学报，2011，39(3):144－146.