一株沿海滩涂细菌的降油及生长特性研究

王斌周雅飞张兴郑峰伟高钰婷何洁周一兵

(1.大连海洋大学农业部北方海水增养殖重点实验室,辽宁大连116023;2.大连海洋大学辽宁省海洋生物资源恢复与生境修复重点实验室,辽宁大连116023)

一株沿海滩涂细菌的降油及生长特性研究

王斌1、2,周雅飞1,张兴1,郑峰伟1,高钰婷1,何洁1,周一兵1、2

(1.大连海洋大学农业部北方海水增养殖重点实验室,辽宁大连116023;2.大连海洋大学辽宁省海洋生物资源恢复与生境修复重点实验室,辽宁大连116023)

采用以原油为唯一碳源的基础培养基,从原油污染的沿海滩涂土壤中分离筛选具有降油性能的细菌;采用柴油培养基测定分离菌株对柴油的原始降解率;通过在柴油培养基中添加不同浓度的葡萄糖 (0、1、2、4、8、16 g/L),及不同浓度的酵母膏、蛋白胨、尿素、硫酸铵 (以氮计,浓度为0.5、1、2 g/L)和磷酸二氢钠 (0、4、8、12 g/L)后,测定分离菌株的降油性能;鉴定分离菌株并研究其生长特性。结果表明:共分离到5株能以原油为唯一碳源生长的细菌,其中1株原始降油率最高 (19.0%),编号为Y-3;在添加1 g/L以上葡萄糖时,Y-3菌株降油率升高,添加4 g/L葡萄糖时达最高 (79.9%);酵母膏和蛋白胨可提高Y-3菌株的降油率,尿素、硫酸铵和磷酸盐对降油率影响不明显;根据形态学、生理生化鉴定以及16S rDNA序列分析,确定Y-3菌株为恶臭假单胞菌Pseudomonasputida,Y-3菌株的最适生长温度为30℃,最适生长pH为8,适宜生长NaCl浓度为0～30 g/L。

石油降解菌;生理生化鉴定;16S rDNA序列分析;生长特性

海上溢油事故的不断发生导致海洋环境的石油类污染成为世界性的问题,由此造成了部分海湾环境恶化、生物绝迹[1-2]。石油污染常用的修复方法有物理、化学和生物修复,其中生物修复对人和环境造成的影响小且修复费用仅为物理、化学修复的30% ～50%[3]。目前,国内外对微生物降解石油的研究非常广泛,应用于海洋溢油的降解菌也有较多报道[4-8]。在修复环境中接种的外源微生物面临多重压力:一是土著微生物的竞争作用,二是环境中生态因子的适宜性,三是被修复环境中污染物的环境毒性。由于这几方面的压力使接种的外源微生物的存活率很低或活性较弱,限制了其应用效果[4-9],研究细菌的降油性能及其在原位修复中的实际应用是目前研究的热点。本研究中,作者从原油污染的沿海滩涂土壤中分离筛选石油降解菌,同时研究添加不同营养素后细菌的降油性能,以期为海洋溢油的生物处理提供更多的材料及试验数据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 样品 土壤样品采自辽宁省盘锦市原油污染的滩涂,24 h内带回实验室进行细菌分离。原油样品采自盘锦油田,柴油样品为市售0号柴油。1.1.2 培养基 基础无机盐培养基包含NaCl 10 g,NH4Cl 0.5 g,KH2PO40.5 g,K2HPO41 g,KCl 0.01g,MgSO4·7H2O 0.5 g,CaCl20.002 g, FeSO40.01 g,蒸馏水1 L,pH为7.2,在121℃下高压蒸汽灭菌20 min。分离富集培养基为100 mL基础无机盐培养基中加入2 g原油,在121℃下高压蒸汽灭菌20 min。生长特性及菌种保存培养基为营养琼脂斜面(或平板)和牛肉膏蛋白胨液体培养基。柴油培养基为100 mL灭菌后的基础无机盐培养基中加入0.1 mL市售0号柴油(115℃下灭菌30min)。营养素添加培养基为100mL基础无机盐培养基中分别加入不同浓度的葡萄糖、氮源(酵母膏、蛋白胨、尿素和硫酸铵)、磷酸二氢钠,在115℃下灭菌30 min后,再加入灭菌后的柴油。

1.2 方法

1.2.1 降油菌株的分离及筛选 取土壤样品10 g加入到盛有90mL无菌水并带有玻璃珠的三角烧瓶中,振摇约20 min使样品与水充分混合,静置后取上清液10 mL,加入到盛有100 mL富集培养基(含原油20 g/L)的三角烧瓶中,在25℃、150 r/min的条件下振荡培养5 d。将培养液梯度稀释,涂布到分离富集培养基平板上,于25℃恒温培养箱中培养2 d,取单菌落经多次分离纯化后,转接至营养琼脂斜面,保存备用。

1.2.2 菌株原始降油率的测定 将保存的分离菌株接种到牛肉膏蛋白胨液体培养基中,在25℃下培养24 h,取2 mL浓度为109cell/mL的菌悬液(显微直接计数)接种到100 mL柴油培养基中,在25℃、150 r/min的条件下振荡培养5 d,每株细菌各设3个平行。在SPECTRUM754型紫外分光光度计上扫描柴油的最大吸收波长,在最大波长处测得各组样品的OD值,按下式计算降油率:

降油率 (D)= (A0-Ai)/A0×100%,

其中:A0为对照组5 d后残余柴油的吸光度;Ai为试验组5 d后残余柴油的吸光度。然后取其平均值并进行统计分析,复筛出降油率较高的菌株[10-11]。

1.2.3 添加碳、氮和磷后菌株降油率的测定 选择原始降油率最高的分离菌株用牛肉膏蛋白胨液体培养基在25℃下培养24 h,然后分别接种2 mL菌悬液 (浓度为109cell/mL)到100 mL含不同浓度葡萄糖(0、1、2、4、8、16 g/L),不同浓度的氮源,包括酵母膏、蛋白胨、尿素和硫酸铵 (以氮计,浓度分别为0.5、1、2 g/L),不同浓度的磷酸二氢钠(0、4、8、12 g/L)柴油培养基中,在25℃、150 r/min的条件下振荡培养5 d,同法测定柴油含量并计算平均降油率,每个梯度各设3个平行。

1.2.4 菌株的鉴定 根据 《常见细菌系统鉴定手册》,对复筛所得降油性能最好的菌株进行形态观察和生理生化鉴定[12-13],并送宝生物工程 (大连)有限公司测定16S rDNA序列,将测序结果在Gen-Bank中进行比对,并使用Mega 5软件构建系统发育树,以此确定其分类位置。

1.2.5 菌株的生长特性

1)适宜生长温度 将筛选所得降油性能最佳的菌株采用 “1.2.3”中的方法培养后,挑取一环接种到牛肉膏蛋白胨液体培养基中,分别在4、10、20、25、30、37、40℃下静置培养24 h,每个梯度设3个平行。以不接种菌株的培养基为对照,测定各试验组的菌体密度 (OD600nm)。

2)适宜生长NaCl浓度 接种试验菌株到含NaCl为0、10、20、30、40 g/L的牛肉膏蛋白胨水中,每个梯度设3个平行,在25℃、150 r/min条件下培养 24 h,测定各试验组的菌体密度(OD600nm)。

3)适宜生长pH 测定试验菌株在pH为5、6、7、8、9、10的牛肉膏蛋白胨水中的菌体密度(OD600nm)。

1.3 数据处理

采用SPSS 18软件对试验结果进行统计分析,采用Duncan法进行多重比较。

2 结果

2.1 石油降解菌的分离、筛选

经富集培养和分离纯化共得到5株能以原油为唯一碳源生长的细菌,编号分别为Y-1、Y-2、Y -3、Y-4、Y-5,其形体特征见表1。尽管原始分离菌株能在以原油为唯一碳源和能源的培养基上生长,但其对油的利用能力差异极大。因此,选择以柴油为唯一碳源和能源的培养基对分离菌株的降解能力进行测定,复筛出降油率最高的菌株进行深入研究。

表1 分离菌株的形态特征Tab.1 Morphological characteristics of the isolated strains

2.2 分离菌株的原始降油性能

在紫外分光光度计上对柴油进行最大吸收波长扫描,得到最大吸收波长为221 nm。在此波长下,测得各组的分光光度值,得出降油率最高(19.0%)为Y-3菌株 (图1),并以Y-3菌株作为目标菌株进行后续试验。

2.3 Y-3菌株在添加碳、氮和磷后的降油性能

添加不同浓度的葡萄糖后,Y-3菌株的降油率均有所提高,当葡萄糖浓度为4 g/L时,降油率可提高到79.9%,说明补充葡萄糖对Y-3菌株的降油性能有明显的促进作用 (P＜0.01);添加酵母膏和蛋白胨,可明显提高Y-3菌株的降油率,并随添加浓度的升高降油率有上升的趋势(P＜0.01),但尿素、硫酸铵和磷酸盐对Y-3菌株的降油性能作用不明显(P＞0.05),如图2、图3所示。

图1 分离菌株的原始降油率Fig.1 Original degradation rate of the crude oil by the isolated strains

图2 葡萄糖浓度和NaH2PO4浓度对降油率的影响Fig.2 Impact of the concentrations of glucose and NaH2PO4on oil degradation

图3 不同氮源及其浓度对降油率的影响Fig.3 Impact of the nitrogen sources and concentration on oil degradation

图4 电镜下Y-3菌株的形态 (15 000×)Fig.4 Electronic scopy m icrograph of the Y-3(15 000×)

2.4 Y-3菌株的鉴定

1)形态学特征 Y-3菌株为革兰氏阴性短杆菌,无芽孢;菌落圆形,光滑,直径为2～3 mm,乳白色,具运动性;电镜下见单极生鞭毛 (图4)。

2)生理生化鉴定 通过对Y-3菌株进行生理生化鉴定,结果显示,其与恶臭假单胞菌Pseudomonasputida特征相符 (表2)。

将Y-3菌株的16S rDNA序列测序结果输入GenBank进行比对,发现其与恶臭假单胞菌的同源性达到100%,使用Mega 5软件构建Y-3菌株与假单胞菌属Pseudomonas属内其它菌株的系统发育树,表明Y-3菌株与恶臭假单胞菌聚为一枝 (图5)。综上所述,可确定Y-3菌株为恶臭假单胞菌。

2.5 Y-3菌株的生长特性

从图6可见:Y-3菌株最适生长温度为30℃; Y-3菌株在NaCl浓度为0～30 g/L时生长情况相差不大,在40 g/L时生长骤减,表明该菌株可耐盐生长;最适生长pH为8。

3 讨论

本研究中从分离获得的几株原油降解菌中选择原始降油率相对较高的Y-3菌株,进行了不同营养素添加后对柴油降解性能的测定,发现添加少量葡萄糖可明显提高其对柴油的降解能力,提高幅度优于添加不同有机氮。细菌的原始降油率通常不高[14-16],有学者认为石油可提供微生物碳源,但N、P营养的缺乏往往是影响细菌生长繁殖的主要原因,补充氮源有助于提高原始降油率[17-18]。本研究中发现,有机氮可提高试验菌对柴油的降解率,但添加葡萄糖对分离菌降油率的提升作用强于添加各种氮源,此种现象目前鲜见报道。微生物在降解环境特殊污染物质的过程中存在 “共代谢”作用[19],关于 “共代谢”的研究目前多见于环境废水中特殊难降解物质的微生物代谢过程[20-21]。鉴于Y-3菌株对柴油的原始降解率较低,而在添加基础碳源后其降油率明显提高,推测Y-3菌株对柴油中的某些成分可能存在 “共代谢”现象,这为今后利用微生物在原位或异位石油污染修复过程中,提高菌体的降油效能提供了新的立足点,Y -3菌株对柴油中哪些成分存在 “共代谢”还有待于深入的研究。

图5 Y-3菌株的系统发育树Fig.5 Phylogenetic tree of Y-3

表2 Y-3菌株的生理生化特征Tab.2 Biochem ical and physiological characteristics of thestrain Y-3

图6 Y-3菌株适宜生长温度、NaCl浓度和pHFig.6 The optimal tem perature,NaCl concentration,and pH for Y-3 grow th

本研究中分离的Y-3菌株经生理生化特征和16S rDNA序列测定及比对,鉴定为恶臭假单胞菌。有关假单胞菌属降解石油的报道很多[11,6-7,22],但大多未鉴定到种。关于恶臭假单胞菌对长链烷烃、多环芳香烃等降解机制的研究较多,但对其在石油污染修复中应用的报道较少。本研究中报道的Y-3菌株生长的温度、NaCl浓度、pH范围均适合海洋环境,因此,Y-3菌株可作为海洋石油污染修复菌种进行研究和开发,尤其对于石油各组分的降解能力及代谢机制,降解基因的存在方式及其调控机制是今后研究的重点。

[1] 曲维政,邓声贵,岳淑红,等.海洋石油污染对海气正常交换过程的破坏性影响[J].自然灾害学报,2002,11(4):55-59.

[2] 陈建秋.中国近海石油污染现状、影响和防治[J].节能与环保,2002,30:15-17.

[3] Hicks B N,Caplan JA.Bioremediation:A natural solution[J]. Pollution Engineering,1993,25(2):30-33.

[4] 夏文香,郑西来,李金成,等.海滩石油污染的生物修复[J].海洋环境科学,2003,22(3):74-79.

[5] 丁明宇,黄健,李永祺,等.海洋微生物降解石油的研究[J].环境科学学报,2000,21(1):84-88.

[6] 邵宗泽,许哗,马迎飞,等.2株海洋石油降解细菌的降解能力[J].环境科学,2004,25(5):133-137.

[7] 田胜艳,刘廷志,高秀花,等.海洋潮间带石油烃降解菌的筛选分离与降解特性[J].农业环境科学学报,2006,25(S1):301-305.

[8] 谢鲲鹏,周集体,曲媛媛,等.一株耐盐原油降解菌的分离鉴定及其降解特性研究[J].海洋环境科学,2009,28(6):680-683.

[9] 夏北成.环境污染物生物降解[M].北京:化学工业出版社, 2002:222-385.

[10] GB17378.4—2007,国家标准海洋监测规范第4部分:海水分析[S].北京:中国标准出版社,2008.

[11] 王战勇,顾贵洲,苏婷婷,等.石油降解菌株Pseudomonassp. DY12的筛选及降解性能研究[J].化学与生物工程,2009,26 (8):67-87.

[12] 沈萍,陈向东.微生物学实验[M].北京:高等教育出版社, 2007:110-120.

[13] 东秀珠,蔡妙英.常见细菌系统鉴定手册[M].北京:科学出版社,2001:370-384.

[14] 杨雪连,李凤梅,刘婉婷,等.高效石油降解菌的筛选及降解特性[J].农业环境科学学报,2008,72(1):230-233.

[15] 李玉素,李法云,张志琼,等.辽河油田冻融石油污染土壤中原位修复微生物[J].辽宁工程技术大学学报,2008,27(4): 599-601.

[16] 陈璧娥,刘祖同.湄洲湾海洋细菌降解石油烃研究[J].石油学报,2001,17(5):31-35.

[17] Oh Y S,Sim D S,Kim S J,et al.Effects of nutrients on crude oil biodegradation in the upper intertidal zone[J].Marine Pollution Bulletin,2001,42(12):1367-1372.

[18] 田胜艳,王娟,聂立红,等.两种N源对石油烃降解菌群降解柴油能力的影响[J].海洋环境科学,2009,28(1):26-29.

[19] Arp D J,Yeager C M,Hyman M R,et al.Molecular and cellular fundamentals of aerobolic cometabolism of trichloroethylene[J]. Biodegradation,2001,12(2):81-103.

[20] 瞿福平,张晓健,何苗,等.氯苯类有机物生物降解性及其代谢作用研究[J].中国环境科学,1997,17(2):142-146.

[21] Saul M T.Aerobic comatabolism of halogenated aliphatic hydrocarbons:A technology overview[J].Remediation Journal,2007, 11:29-36.

[22] 徐冯楠,冯贵颖,马雯,等.高效石油降解菌的筛选及其降解性能研究[J].生物技术通报,2010(7):221-226.

The grow th and petroleum degradation characteristics of bacteria in coastal beach

WANG Bin1,2,ZHOU Ya-fei1,ZHANG Xing1,ZHENG Feng-wei1,GAO Yu-ting1,HE Jie1,ZHOU Yi-bing1,2
(1.Key Laboratory of Mariculture&Stock Enhancement in North China's Sea,Ministry of Agriculture,Dalian Ocean University,Dalian 116023, China;2.Key Laboratory of Marine Bio-resources Restoration and Habitat Reparation in Liaoning Province,Dalain Ocean University,Dalian 116023,China)

The bacteria that have capability to degrade crude oil were isolated from the coastal beach polluted by crude oilwith the basalmedium crude oil as only carbon source.The original degradation rate of diesel oil by the isolated strains was determined.In addition,the degradation rate of diesel oil by the isolated strain was determined with the basalmedium diesel oil including different concentration of glucose(0,1,2,4,8,16 g/L),the different concentrations of yeast extract,peptone,carbamide,(NH4)2SO4(according to the content of nitrogen:0.5, 1,2 g/L)and NaH2PO4(0,4,8,16 g/L).The isolated strain was identified and growth characteristicswere studied.The results showed:5 strains bacteria grew on the basalmedium crude oil as only carbon source.One of these stains had amaximum original degradation rate(19.0%)and was numbered as Y-3.The degradation rate of Y-3 increased and reached to 79.9%in the diesel oilmedium supplemented with glucose(4 g/L).The degradation rate was increased in Y-3 in addition of yeastextractand peptone also,butnotnotable in added urea,(NH4)2SO4and NaH2PO4.The Y-3 was identified asPseudomonasputidaaccording to the resultof themorphology,physiological characteristics and 16S rDNA sequence analysis.The Y-3 had fitting growth at temperature of 30℃,pH 8, and NaCl concentration of 0-30 g/L.

diesel oil;biodegradation;bacterial identification;growth characteristics

X172

A

2095-1388(2012)04-0306-05

2012-12-01

国家 “863”计划项目 (2006AA10Z410);国家海洋公益性行业科研专项经费项目 (200805069)

王斌 (1962-),女,教授。E-mail:wangbin@dlou.edu.cn

周一兵 (1957-),男,教授。E-mail:ybzhou@dlou.edu.cn