饲料中添加三种芽孢杆菌对建鲤生长及肠道菌群比较研究

尹 恒高启平谢 骏刘 波李云兰

(1.通威股份有限公司，四川成都 610041；2.中国水产科学研究院淡水渔业研究中心，农业部淡水鱼类遗传育种和养殖生物学重点开放实验室，江苏无锡214081)

肠道作为鱼类自身最大的免疫器官，肠道健康状况直接影响营养物质的消化与吸收，同时也影响鱼体的免疫、抗病力，肠道健康状况在养殖中越来越受到重视。保持鱼类肠道健康必须要有充足的营养供给、保证原料的新鲜、添加药物如抗生素等措施，但由于不规范用药的现象比较突出，药残的问题成为大家关注的热点。既要减少药残，又要促进动物肠道健康，添加微生态制剂成了目前有效的方式之一。

微生态制剂作为抗生素的替代选择，可以降低药物残留、促进动物生长、提高健康水平，维护生态平衡，在养殖与饲料中的研究与应用日益得到重视与加强。应用于养殖的微生物菌种包括：芽孢杆菌、乳酸菌、酵母菌、光合细菌、硝化细菌等单一菌群微生态制剂或不同菌群的复合微生态制剂，而芽孢杆菌由于有较强的产胞外酶的能力，能刺激并提高动物免疫能力，同时稳定性好、抗性强、复活率高，在养殖及饲料中的研究应用较多。已有研究表明，在水产饲料中添加芽孢杆菌，可以抑制肠道内有害菌的繁殖，促进肠道有益菌生长，维持动物肠道的菌群平衡，同时可以提高动物的消化酶活性，增强机体免疫功能，达到促进动物生长。但目前研究菌种主要集中在枯草芽孢杆菌和地衣芽孢杆菌上，蜡样芽孢杆菌、凝结芽孢杆菌在水产动物中的研究应用则较少。因此，本试验以当年建鲤作为试验对象，比较研究在实用饲料中添加枯草芽孢杆菌、蜡样芽孢杆菌、凝结芽孢杆菌等3种芽孢杆菌对鲤鱼的生长和肠道菌群的影响，为芽孢杆菌的应用提供参考。

1 材料与方法

1.1 试验鱼

试验选用的当年建鲤购自德阳养殖户处，初始平均体重为（14.62±0.11）g，体质健康。

将鱼种随机分成4组，每组3个重复，每个重复120尾，共12个水泥池（规格为7 m×7 m×1.5 m）。

1.2 饲料与试验设置

共设计4种试验料，编号为1号、2号、3号、4号，其中,1号为对照料，2号、3号、4号分别在1号料的基础上添加0.1%凝结芽孢杆菌(中国水产科学研究院淡水渔业研究中心提供)、0.1%蜡样芽孢杆菌 (通威股份水产科技公司基因研究室提供)、0.1%枯草芽孢杆菌(湖北某厂家提供),菌种采用逐级稀释添加到预混料中,再与大原料充分混合均匀，饲料中所含的细菌个数均为1.5×1010个/kg。试验饲料在通威股份有限公司四川分公司生产，先配后粉工艺，料型为沉性硬颗粒饲料，原料80%过40目筛，三级调质器，调质温度90℃,粒径为4.5 mm，日粮配方组成和营养水平见表1。

表1 试验料配方及营养水平（g/100 g）

1.3 饲养管理

试验在室外的水泥池中进行（7 m×7 m×1.5 m，每个水泥池由聚乙烯网片和钢管隔成四格,每个格子为1个重复,由于各试验池的条件存在一定差异,各试验组均设1个对照组）。各池均有独立的进排水口,水源为东风渠道来水 (都江堰来水)。试验从2008年6月14日开始，至9月16日结束,养殖94 d，试验期间平均水温为27.3℃，平均溶氧大于5mg/l，pH值8.0，氨氮平均值0.2mg/l,亚硝酸盐平均值0.001 5mg/l,COD平均值5.57mg/l。所有试验组日投饲3次，各处理组之间保持相同投饲率，每隔一段时间根据鱼的摄食情况调整投饲量。

1.4 测定指标与方法

1.4.1 生长指标

生长试验结束后，测定各组的总体重，计算饲料系数（FCR）、特定生长率（SGR）。

饲料系数（FCR）＝投饲总量/增重量；

特定生长率(SGR，%/d)＝（Ln末重-Ln 初重）/养殖天数×100。

1.4.2 肠道菌群测定

生长试验结束后，每个处理组随机取3尾鱼（饱食投喂2 h后），用75%酒精消毒鱼体表，打开腹腔消毒肠管外壁，无菌棉线结扎，用无菌水冲洗，无菌条件下取出中肠食糜。用无菌生理盐水配成10-1～10-5倍菌悬液，选 10-3、10-4、10-5三个稀释度，每个稀释度各取100 μl以平板涂布法均匀涂布于选择性培养基上，放于培养箱中，在30℃下需氧培养24 h后，取菌落数在30～300个之间的稀释度进行计数报告，所测菌群数量用lgcfu/g表示。

异养细菌总数测定采用LB培养基（自配）：胰蛋白胨 10 g/l、酵母提取物 5 g/l、NaCl 5 g/l，加水定容至1 000 ml，用1 mol/l的NaOH调节pH值到7.4。

大肠杆菌（肠道致病菌及肠球菌）分离培养基：采用麦康凯选择培养基（MAC），市售，杭州天和试剂厂。

致病性弧菌的选择性培养：采用TCBS选择培养基（硫代硫酸钠-枸椽酸盐-胆盐-蔗糖琼脂平板），市售，杭州天和试剂厂。

乳酸菌选择培养基：采用改良番茄汁琼脂培养基(TJA)(自配)：番茄汁 50 ml、酵母浸粉 5 g、牛肉浸膏 10 g、乳糖 20 g、葡萄糖 2 g、吐温-80 1 ml、醋酸钠 5 g、琼脂15 g、蒸馏水 1 000 ml，调 pH 值到 6.8±0.2。

以上所有培养基配好后，121℃高压蒸汽灭菌15～20 min。

每克肠道食糜菌落数(cfu/g)=平均菌落数×稀释倍数×10（如果涂布量为 50 μl，则×20）。

1.5 数据统计

采用SPSS13.0统计软件，对数据作单因素方差分析(one way ANOVA)，若组间差异显著，则做Duncan′s法多重比较，显著水平P采用0.05。所有的结果均以“平均值±标准差”（±SD）表示。

2 结果

2.1 添加3种芽孢杆菌对建鲤生长性能的影响(见表2)

表2 添加3种芽孢杆菌对鲤鱼生长性能的影响

投喂3种不同的芽孢杆菌，生长94 d后，结果表明，与对照组相比，添加0.1%的凝结芽孢杆菌组特定生长率（SGR）增加了 3.00%（P＜0.05），降低饲料系数（FCR）5.0%（P＞0.05）。添加0.1%蜡样芽孢杆菌组的饲料系数比对照组下降2.50%（P＞0.05），特定生长率(SGR)增加了0.5%（P＞0.05）。而添加0.1%枯草芽孢杆菌组的饲料系数比对照组显著增加5.63%（P＜0.05），SGR比对照组显著降低3.0%（P＜0.05）。

2.2 添加3种芽孢杆菌对鲤鱼肠道菌群的影响（见表3）

表3 添加不同芽孢杆菌对鲤鱼肠道菌群的影响（lgcfu/g）

在饲料中添加芽孢杆菌后，各试验组的鲤鱼肠道内的细菌总数比对照组增加，其中0.1%蜡样芽孢杆菌组、0.1%枯草芽孢杆菌组与对照组相比差异显著 (P＜0.05)。与对照组相比，添加0.1%的凝结芽孢杆菌使肠道内的乳酸菌数量显著增加(P＜0.05)，弧菌及大肠杆菌数量显著下降(P＜0.05)，添加0.1%的蜡样芽孢杆菌使肠道内的乳酸菌数量增加,弧菌数量下降,但与对照组相比差异均不显著(P＞0.05)，添加0.1%的枯草芽孢杆菌对肠道内的弧菌数量没有显著影响(P＞0.05)，使乳酸菌数量减少(P＞0.05)，大肠杆菌数量显著上升(P＜0.05)。

3 讨论

3.1 添加不同芽孢杆菌对鲤鱼生长的影响

芽孢杆菌具有较强的分泌胞外酶的能力。休眠的芽孢进入动物消化道后，在适宜的温度、水分和充足的养分供给下，能萌发形成营养体，营养体分泌多种酶类。包括淀粉酶、蛋白酶、脂肪酶以及多种非淀粉多糖酶，Kerovuo等成功地从枯草芽孢杆菌中分离出植酸酶基因，并将其在胚芽乳杆菌中进行表达。芽孢杆菌的代谢产物还包括氨基酸、维生素、有机酸等，这些物质能提高饲料的消化吸收率，促进动物的生长。芽孢杆菌的种类比较多，目前允许饲用的芽孢杆菌菌种包括：枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）、纳豆芽孢杆菌（Bacillus natto）、蜡样芽孢杆菌（Bacillus cereus）、凝结芽孢杆菌（Bacillus coagulans）、缓慢芽孢杆菌（Bacillus lentus）、地衣芽孢杆菌（Bacillus licheniformis）、短小芽孢杆菌（Bacillus pumilus）、环状芽孢杆菌（Bacillus circulans）、巨大芽孢杆菌（Bacillus megaterium）、坚强芽孢杆菌（Bacillus firmus）、东洋芽孢杆菌（Bacillus toyoi）。农业部公布的饲用添加剂目录中将地衣芽孢杆菌和枯草芽孢杆菌列为允许在饲料中添加的菌种。水产上关于枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌对动物的生长影响有不少的研究，如华雪铭等在饲料中添加芽孢杆菌提高了暗纹东方鲀（Fasciatus takifugu）幼鱼肠道的淀粉酶活性和蛋白质合成，促进了生长。刘波等在异育银鲫(Carassius auratus gibelio)饲料中添加地衣芽孢杆菌增加了肠道消化酶活性，促进了鱼体生长。丁贤等用含芽孢杆菌的饲料投喂凡纳滨对虾（Litopenaeus vannamei），试验组凡纳滨对虾的淀粉酶、脂肪酶和蛋白酶活性均高于对照组。凝结芽孢杆菌(B.coagulans)是一种既能产生孢子又能产乳酸的革兰氏阳性细菌。由于其特殊的生理特征（能产乳酸），曾经被误命名为芽孢乳杆菌(Lactobacillus sporogenes)，在1939年被更正为凝结芽孢杆菌(B.coagulans)。已有研究表明，它能抵抗pH值3.0的酸性环境，并能忍受0.3%(W/V)的胆汁盐，因而具有很强的在消化道中生存的能力。在畜禽和水产上有研究表明，在饲料中添加凝结芽孢杆菌能促进动物的生长、提高营养物质的利用。袁丰华等、付天玺等发现，饲料中添加1.0×1012cfu/kg的凝结芽孢杆菌能显著促进尖吻鲈、奥尼罗非鱼的生长和饲料营养物质的利用，满足最佳生长。但是也有不同的研究表明，饲料中添加芽孢杆菌添加的剂量与动物的生长有一定的关系，如江萍等对鲤的网箱养殖中发现,饲料中添加0.2%的芽孢杆菌，增重率和饵料系数下降，而华雪铭等在异育银鲫的饲料中添加不同浓度的芽孢杆菌对增重有显著影响，其中添加0.2%的芽孢杆菌组相对增重率比对照组提高33%，但添加0.1%组、0.4%组与对照组相比差异不显著。

本次试验中3种不同的芽孢杆菌对鲤鱼的生长影响不一致，其中凝结芽孢杆菌和蜡样芽孢杆菌对鲤鱼的生长具有一定的促进作用，但枯草芽孢杆菌没有表现出促进生长的作用，这可能与菌株的特异性有关。菌种本身的理化特性是影响微生态制剂产品质量和应用效果的关键因素。不同的菌种，其理化特性、代谢产物有一定的差异，由此引起的作用效果也不尽相同。赵庆新等对草鱼、青鱼、白鲢、鳙鱼、团头鲂、三角鲂、鲤鱼和鲫鱼等4个亚科鱼肠道菌群中的好氧菌或兼性厌氧菌进行了分离鉴定，结果发现同一亚科的鱼内菌群分布有极高的相似性。而不同亚科的鱼间菌群分布有较大的差异，哈夫尼亚菌属、致病杆菌属、气单胞菌属、柠檬酸菌属、假单胞菌属在这8种鱼中有较高的广谱系数(9.893 7～19.017 7),且其x2检验不显著：而链球菌属、拉思氏菌属、芽孢杆菌属和葡萄球菌属的广谱系数很低，各自只在1种或2种亚科中能检测到，因此属于专一性共生菌，芽孢杆菌的数量级也比较低，只能零星检出。一般来说，土著菌种的适应性、增殖效果、稳定性要好于引进的菌种，而市场上的芽孢杆菌产品大多还是从畜禽产品转为水产用，这也可能是本次试验中所添加的枯草芽孢杆菌没有促进鲤鱼生长的原因之一。

3.2 添加不同的芽孢杆菌对鲤鱼肠道菌群的影响

水体中含有大量的细菌，对早期肠道菌群的组成起着决定作用，水体中的细菌组成与鱼类肠道内定植的细菌群，尤其是原籍菌群，有着某种必然的联系。动物肠道固有菌群中，厌氧菌占90%以上，它们构成动物肠道的屏障之一，对外界细菌有明显的拮抗作用。正常条件下，鱼肠道内的细菌种类和数量处于动态的平衡中。环境恶化、感染疾病、密度过大等因素会破坏这种平衡，使病原菌或条件致病菌异常增殖，从而养殖对象表现出病理状态，生长性能下降。芽孢杆菌抗菌的机理在于芽孢杆菌在繁殖过程中消耗肠道内的氧,降低肠道上皮细胞膜的氧化还原电势电位,同时在代谢过程中产生的有机酸如乙酸、丁酸等，这些均能抑制病原菌的生长，而利于厌氧菌的繁殖。有研究表明，在饲料中添加芽孢杆菌能抑制大肠杆菌、弧菌等条件致病菌的数量，增加乳酸菌等有益菌的数量。刘波等发现，在异育银鲫饲料中添加0.02%的地衣芽孢杆菌，食糜中乳酸杆菌数量显著增加，大肠杆菌数量显著下降。王鲲等在牙鲆饲料中添加1株鱼源芽孢杆菌(克劳氏芽孢杆菌Bacillus clausii)后发现，其能抑制牙鲆肠道病原菌，有利于改善牙鲆肠道健康。于明超等在凡纳滨对虾饲料中添加芽孢杆菌，结果发现对虾肠道内的细菌数量和组成都有所改变。

在本次试验中，添加3种芽孢杆菌后肠道食糜中弧菌数量均有不同程度的下降，添加凝结芽孢杆菌和蜡样芽孢杆菌后，乳酸菌的数量有所增加，特别是添加0.1%的凝结芽孢杆菌后，鲤鱼肠道食糜中的乳酸菌数量比对照组显著增加，弧菌及大肠杆菌的数量比对照组显著下降，这与刘波等的研究结果是一致的。这表明添加凝结芽孢杆菌后，使鲤鱼肠道内的微生态平衡较好，从而促进了鲤鱼的生长。但试验结果表明，添加枯草芽孢杆菌降低了弧菌的数量，乳酸菌的数量也有降低的趋势，这与其显著降低了鱼体的生长呈现一定的相关性，具体的原因还有待进一步试验。

4 小结

本次试验发现，在初始体重为(14.62±0.11)g的建鲤中单独添加0.1%的枯草芽孢杆菌、凝结芽孢杆菌及蜡样芽孢杆菌对鲤鱼的生长和肠道菌群的影响不一样。添加凝结芽孢杆菌，可以明显促进鲤鱼生长，显著抑制肠道内弧菌与大肠杆菌，显著增加肠道内的乳酸菌数量；添加蜡样芽孢杆菌鲤鱼生长有一定的作用，抑制肠道内弧菌，增加乳酸菌的数量，但效果均不显著；添加枯草芽孢杆菌则抑制了鲤鱼的生长，一定程度上降低弧菌的数量，减少了肠道内乳酸菌的数量。由此可见，在鲤鱼饲料中添加凝结芽孢杆菌和蜡样芽孢杆菌对鲤鱼的生长和肠道健康是有益的，单独添加枯草芽孢杆菌的效果则有待进一步研究。

20篇，刊略，需者可函索）