利用体外培养法测定精补料的营养价值

艳 城 内蒙古农业大学，内蒙古呼和浩特 010020

通过饲料营养价值评定，可以了解和掌握各种动物对饲料养分的利用情况、需要量及其变化规律，为科学饲养奠定理论基础。目前，评定饲料营养价值的方法主要有概略养分分析法、体内法和体外法。概略养分分析法是评定饲料营养价值的一种常用方法，如总能、总磷、粗蛋白、粗脂肪、粗纤维等的测定方法。但利用此法所得的饲料养分与动物消化吸收的养分之间存在很大差异，不足以准确地反映饲料的实际营养价值。体内法是评定饲料在瘤胃内降解率的直接方法。体内法测定动物对饲料的采食量、消化率和利用率，并以此评估饲料的营养价值。然而，应用传统的体内法来检测饲料的消化率，实验周期长、费用高，并且需要大量的样品，不便于大规模进行。另外，由于实验动物个体间差异较大，实验结果可重复性较差，不利于测定方法的标准化。随着动物消化生理研究的深入和技术手段的创新，利用动物体外消化模拟技术来研究饲料的营养价值已成为可能。因此人们建立了体外法来研究饲料的营养价值。体外法是借助生物学方法体外模拟动物消化过程估测饲料消化率。体外试验技术因其操作方法较易掌握、实验周期短、重复性好等特点得到了广泛的应用。在反刍动物饲料营养价值评定中采用的体外方法较典型的有：Tilley和Terry(1963)建立的两步法 （两级离体法）、体外产气法（HFT技术）和体外连续培养法。

目前，应用最广泛的是Tilly和Terry（1963）提出的一步法和此后改进的两步法（即两级离体法）。它是将瘤胃液过滤后与待测饲料在厌氧环境、适宜的温度（38℃～39℃）和 pH（6.7～6.9）等条件下共同培养48h后，再用瘤胃蛋白酶（pH大约为2）培养48h，以模拟饲料在瘤胃、真胃和部分小肠的消化过程。根据发酵培养管内残留物的分析结果，估测饲料消化率。测定饲料营养成分大多采用差值法。体外产气法是Raab,L.等（1983）和德国荷恩海姆大学动物营养研究所Menke K.H等人建立的，是目前采用最多的用来评价饲料营养价值的方法之一。国外文献多称该方法为HFT技术。此方法是基于饲料样品在体外用瘤胃液消化所产生气体的比率来估计饲料消化率。饲料样品的活体外经瘤胃微生物发酵所产生的气体（C O2、CH4、H2）为微生物的代谢产物，因此，在一定的代谢途径下，可以利用气体产生的数量或速度反映营养物质被瘤胃微生物发酵的程度和速度。消化率不同的各种饲料，在相应的时间内（一般为24h）产气量与产气率不同。

本文针对利用两步法和体外产气法 （HFT技术）进行饲料的营养价值评定做进一步的概述，即采用瘤胃液对饲料进行体外培养，以达到近似于瘤胃内发酵环境来评定饲料的营养价值。

1 材料与方法

1.1 试验时间、地点

2011年3 月至2011年5月，内蒙古农牧业科学院动物营养所。

1.2 试验动物

营养所试验基地的（具瘤胃瘘管的）绒山羊2只。

1.3 试验材料

市售精补颗粒料，羊草由动物营养所试验基地提供，试验日粮为按表1配制的全混日粮。

瘤胃液采自装有永久性瘤胃瘘管并饲喂精粗料比为40∶60饲粮的内蒙古白绒山羊。

实验试剂：缓冲液、胃蛋白酶溶液；培养液；0.2M盐酸、工作液、A液、B液。

1.4 试验方法

1.4.1 概略养分分析试验方法

表1 全混日粮的配方

营养成分测定方法参照杨胜(1999)的《饲料分析及饲料质量检测技术》。

干物质（DM）：用105℃干燥法测定。

粗脂肪（EE）：采用 SZF-06A脂肪测定仪，将烘干后的样品用滤纸包裹后由玻璃入口放入，再加乙醚，使之反应。4h后取出样品烘干称重，计算出脂肪含量。

粗灰分(Ash)：茂福炉中550℃～600℃下灰化测定。取烘干后的样品移入坩锅碳化、灰化(600℃)至恒重；测定每批样品的粗灰分重量。

粗蛋白(CP)：用凯氏半微量定氮法测定。取烘干后的样品移入消化管进行消化，每份样品中分别加入适量的催化剂和15m l的H2SO4后开始消化。消化完毕后，测定每批样品的粗蛋白含量。

中性洗涤纤维(NDF)：取烘干后的样品移入袋后按Van soest中性洗涤剂法测定。

非纤维性碳水化合物NFC%=100-(NDF%+CP%+Fat%+Ash%)

1.4.2 两极离体试验方法

首先在厌氧、39℃条件下,用瘤胃液的稀释液消化1.5g底物样品 （称取样品1.5g，放入培养瓶中，每管加入120m L的缓冲液混匀，通入CO2，直到其处于饱和状态。放入培养箱中，使其温度达到38℃，然后加入30m L瘤胃液，测定pH并通入CO2，，达到饱和。pH 应保持在 6.7～6.9，利用 1mol/L的NaCO3来加以调整）放入培养箱中培养48h,每天摇动2～3次。在培养开始后6小时和24小时测定pH值并进行调整。然后加入1m L 5%HgCl2,2m L1moL/L的NaCO3以抑制微生物的活动，促进沉淀，弃上清液。然后加入胃蛋白酶150m L在39℃、酸性条件（pH应在1.5左右）下,消化48h。培养结束后,测定残渣中的DM、CP和NDF含量,计算出DMD、CPD和NDFD含量。

1.4.3 体外产气试验方法

产气量的测定：同时进行3个重复的培养,将0.4000g待测样品干物质置于特制的150m L酸奶瓶中,用60m L瘤胃稀释液(20m l瘤胃液+40m l培养液)消化。 记录 1、2、3、6、8、12、24、36、48 各时间点的产气量。采用Groot等(1996)描述的多相组合模拟模型gas(ml)=a1/(1+(k1/t))c1+……+an/(1+(kn/t))cn计算动态消化产气参数。式中：Y为a代表每一饲料组分理论上的最大产气量(ml)；k为对应饲料组分达到最大产气量一半时所需时间 ,h；而c是决定曲线形状的参数；t为培养时间(h)。从产气开始后，按照时间点记录产气量，每次记录完进行放气，使注射器的刻度为零，等下一次记录完毕后又返回到零刻度。由于前几个小时产气较多，记录时间稍微密集一点，以后间隔的时间稍长一点，以此减少试验误差。

活体外pH、NH3-N测定：在39℃、厌氧条件下,将0.2000g待测样品干物质置于特制的150m L酸奶瓶中,用30m L瘤胃稀释液 (10m l瘤胃+20m l培养液)消化。每个培养设3个重复，待培养至24 h时立即测定发酵液pH（采用上海雷磁仪器厂产PHS-3B型高精度酸度计测定）,氨态氮含量测定参照冯宗慈等（1993）方法。

NH3-N测定方法为：依次量取工作液0、1、2、4、6m l置于5个编号的50m l容量瓶内，接着依次加入蒸馏水 10、9、8、6、4m l， 使之成为 10m l。 再用0.2M盐酸定容到刻度处，此系列标准溶液每100m l的含氮量依次为 0、0.2、0.4、0.8、1.2。 准确量取各标准溶液0.4m l分别置于5个10m l试管内，各管内依次加入A液2m l和B液2m l摇匀，静置10分钟后，用722分光光度计于波长700nm处比色，0.5cm的比色皿，用蒸馏水的0号试管作为空白对照，测定各溶液消光值(0号标液保存，测样品时调零点用)。用消光值作为自变量、溶液含N量作为从变量导出回归方程式。做出标线后，从培养液中取10m l于3500～4000r/m in下离心10m in，量取0.5m l上清液置于15m l试管内，再加入9.5m l 0.2M盐酸至10m l摇匀(稀释倍数为20)，比色操作同上所述。把测得的消光值代入回归公式，算得的结果再乘以样品的稀释倍数即为原样品中的氨氮含量。

1.5 试验目的

本试验采用的日粮1为羔羊开口料，日粮2为羔羊育肥料。

在饲养羔羊的过程中，羔羊提前补饲可以促进前胃的发育，增加羔羊营养来源，提高羔羊安全越冬能力，一般羔羊从10日龄开始到断奶前都需进行补饲。补饲前期用开口料饲喂槽羔羊。这个阶段是羔羊由吃母乳逐渐到采食草料的过渡时期，从开始补饲到6周龄以母乳为主，补饲开口料为辅。6周龄到断奶期间以补饲育肥料为主，母乳为辅，在补饲中逐渐增加优质干草与精补料的数量，减少母乳的饲喂量。

羔羊开口料和羔羊育肥料都要求具有全面的营养以及在消化道内易消化降解，因此本试验利用概略养分分析、两级离体和体外产气试验等来综合评价两种日粮的营养价值。

2 结果与分析

2.1 概略养分分析结果

表2 不同比例全混日粮营养成分

图1 不同比例全混日粮营养成分

从图1可以看出两种不同比例全混日粮的营养成分，其中1号样品中的三大营养物质粗蛋白、粗脂肪和碳水化合物的含量较高。

2.2 两级离体实验结果

表2 全混日粮DM消化率、CP消化率、NDF消化率

图2 全混日粮DM消化率、CP消化率、NDF消化率

由上图可以看出，不同比例全混日粮的消化率均为1号样品的高。

2.3 体外产气实验结果

表3 不同比例全混日粮体外产气量

图3 不同比例全混日粮体外产气量

由图3可知，前3h两个样品的差距不大，3～24h内1号样品的产气量明显高于2号样品的产气量，而24h后产气量极少。

表4 不同比例全混日粮产气曲线

图4 不同比例全混日粮产气曲线

由图4可以看出，两种日粮最大产气量分别为91.194（ml）、92.737（ml）。从不同发酵参数之间的相关关系可以看出,在发酵时间比较短的情况下,理论最大产气量受产气速率及延滞时间的影响。而产气速率与主要营养成分的含量之间存在着极显著的相关性。

图5 NH3-N标线

由图5可知，标线y=1.094x-0.022（y：浓度，x：吸光度，原样稀释倍数为20倍）。

表5 NH3-N的浓度

由表5可以看出，1号样品的氨氮浓度明显高于2号样品。

表6 pH值的测定

由表6可以看出，两个样品间pH值差距不大，和绒山羊瘤胃内环境相差不大，均处于正常生理范围(pH值5.5～7.5)内,不会影响瘤胃的发酵功能。

3 讨论与结论

3.1 讨论

（1）不同精粗比日粮对消化率的影响

两级离体技术测定的结果（表2）显示，不同精粗比的饲料其消化率也不同，相对而言1号精补料的消化率比2号精补料的消化率高一些，差异不显著。其粗蛋白的消化率最明显，NDF在瘤胃的消化率是1号样品高于2号样品。这说明，消化率受粗蛋白质的影响，饲料中粗蛋白含量越高其消化率越高。高含量的NDF会降低微生物对全混日粮的降解速率,从而延缓发酵的启动。然而，当日粮中非结构性碳水化合物或易发酵物质的含量较高时,微生物会利用降解产物迅速繁殖,从而提高消化率。

（2）不同精粗比日粮对产气量的影响

一般来说，产气量是反映底物中碳水化合物组分被瘤胃微生物利用程度的标志。体外产气法发酵后的主要产物为CO2、CH4和VFA。然而,VFA在被缓冲剂中和后也会产生少量的气体。因此,可以说产气量反映了底物发酵。产气量多，说明底物中碳水化合物组分含量高或被利用的比例大；产气量少则反之。然而，在底物粗蛋白含量不同的条件下，瘤胃微生物产气量的高低不能完全反映底物被利用的程度。Picard等曾报道，当底物蛋白质含量高时，底物的DMD明显提高，但底物的发酵产气量明显减少。

本试验利用体外产气法研究了2种不同全混日粮的营养价值。从图中可以看出，前3h 1号日粮和2号日粮的产气量差距不太明显，而3～24h的产气量1号日粮明显高于2号日粮，24h以后2号日粮的产气量比1号日粮的高。总的来说，1号日粮的产气量均高于2号日粮。在瘤胃中，2种不同比例全混日粮发酵参数不同，可以说，在瘤胃中被消化吸收的程度不同。精饲料本身较易被动物的瘤胃液消化。不同比例全混日粮的最大产气量为91.194、92.737。从不同发酵参数之间的相关关系可以看出,在发酵时间比较短的情况下,理论最大产气量受产气速率及延滞时间的影响。而产气速率与主要营养成分的含量之间存在着极显著的相关性,由此可以推断其通过营养成分对底物发酵速率起到促进或抑制作用。

（3）不同精粗比日粮对瘤胃氨氮浓度的影响

NH3-N是饲料蛋白质、肽、氨基酸、氨化物、尿素和其它非蛋白质氮化合物分解的终产物,同时又是微生物合成菌体蛋白的原料,其浓度反映的是饲料中蛋白质的降解情况。瘤胃NH3-N浓度在一定程度上反了特定日粮组成下蛋白降解与合成间所达到的平衡状态。由表4可知两试验组氨氮浓度范围是 6.56～25.33mg/100m L，处于已报道的最佳NH3-N浓度 (6.3～27.5 mg/100m l)范围之内（Murphy 等，1987；Ortega 等，1979）。 所以，本试验中两种精粗比日粮均使瘤胃发酵产生了适当的NH3-N浓度。本试验表明，添加不同日粮会直接影响饲料蛋白质在瘤胃内的降解。

（4）不同精粗比日粮对瘤胃pH值的影响

瘤胃碳水化合物发酵的主要产物是乙酸、丙酸和丁酸等VFA，它们是反刍动物主要的能量来源及合成乳脂和体脂的原料。VFA浓度在很大程度上影响瘤胃的pH值，而反过来瘤胃pH值对瘤胃微生物群落也有重要影响。pH值是反应瘤胃发酵情况的发酵水平的综合指标，在1和2试验组中，瘤胃pH值的范围是6.43～6.52，处于Murphy等(1987)所报道的正常范围内。表明两组日粮条件下瘤胃均处于正常发酵状态。正常的瘤胃发酵pH值范围,验证了试验是在正常的发酵环境中进行的,同时也证明了试验数据的可靠性。

3.2 结论

从结果可知，1号样品的消化率均高于2号样品，而体外产气量也表明1号样品的产气量比2号的高。在pH值正常的发酵情况下氨氮浓度也是1号样品的高于2号样品。可以说不同比例的全混日粮在瘤胃中的消化和利用率不同，营养价值也有所不同。

然而，体外培养技术广泛地应用于反刍动物营养研究,得益于其技术简便、费用低,以及相应测定装置的发展。但是，目前仍缺少对不同实验室之间的试验比较,各个实验室之间的数据往往无法比较。同时,各个实验室采用的具体的技术细节和装置不同,难以制定统一的标准化程序。此外,作为一种动物消化模拟技术关键在于与体内环境相似,所以本实验只给饲料营养价值评定中提供理论依据。

［1］杨胜.饲料分析及饲料质量检测技术[M].北京农业大学出版社,1999.

［2］闫贵龙，鲁琳等.氮肥追施量对玉米秸秆营养价值的影响[J].畜牧兽医学报,2006,37(8)：785～792.

［3］Tilly J M A ,Terry R A.A two stage technique for the in vit ro digestion of forage crop s[J].JBr Grassland Soc,1963,18：104～111.

［4］卢德勋等.现代反刍动物营养研究方法和技术[M].农业出版社,1993.

［5］谢春元,杨红建等.体外发酵产气技术在饲料营养价值评定中的应用[J].中国饲料,2007,10：16-19.

［6］彭健,陈喜斌.饲料学（第二版）[M].科学出版社，2008.

［7］杨凤.动物营养学（第二版）[M].中国农业出版社,1998.

［8］Picard D G,Tesser OB,Bianco R A M.Interference of nitorgenous in techniques of invitro rum inal gas production [J].Ciencia e Investigacion Agraria,1998,25(2)：227～232.

［9］张晓庆,吴秋珏等.不同品种苜蓿营养成分及体外消化率动态研究[J].草业科学，2005,12(12)：22.