亚洲Ⅰ型口蹄疫病毒核酸检测标准物质的制备研究

吴亚琼，高志强，吴延功，张鹤晓，乔彩霞，张利峰，单 虎，尹燕博，朱淑芬，王慧珊

（1.青岛农业大学动物科技学院，山东 青岛 266109；2.北京出入境检验检疫局，北京 朝阳 100026；3.中国动物卫生与流行病学中心，山东 青岛 266034；4.山东农业大学动物科技学院，山东 泰安 271018）

口蹄疫是口蹄疫病毒（FMDV）引起的一种急性、热性、高度接触性的偶蹄动物共患传染病，导致幼畜死亡，成年动物生产性能下降［1］。根据Christianson等报道，该病流行范围广，暴发后很难控制和消灭，至今仍没有较好的防治方法，使国际社会畜牧业贸易损失惨重［2-3］。

目前国内进出口检疫经常采用常规RT-PCR和实时荧光定量RT-PCR来检测口蹄疫病毒，其中5′NCR和2B区域的核酸序列在7个型间最为保守，为口蹄疫病毒通用性核酸检测方法的靶区域，而1D区域为分型核酸检测方法的靶区域［4-5］。本研究参考相关项目标准物质的研制方法［6］，针对目前口蹄疫病毒核酸扩增检测缺乏标准物质的现状，以口蹄疫病毒亚洲1型核酸为模板，分别对以上具有检测意义的片段进行RNA标准物质的研究，并由多家实验室运用共同定量的方法对标准物质进行定量分析。

1 材料与方法

1.1 仪器 ROCHE公司的LightCycler 2.0，Roche 480荧光PCR仪，ABI7900HT荧光PCR仪。

1.2 试剂 RiboMAXTMLarge Scale RNA Production System-SP6试剂盒，Taq DNA聚合酶，限制性内切酶Bam HⅠ，购自Promega公司；DNA快速纯化回收试剂盒，质粒快速提取纯化试剂盒，购自TaKaRa公司，Trizol，购自Invitrogen公司；其余所有常规试剂均为分析纯。

1.3 病毒核酸 口蹄疫亚洲Ⅰ型As-1／PK-1／2005病毒核酸，北京出入境检验检疫局动检实验室保存。

1.4 荧光定量RT-PCR引物探针 分别根据5′NCR和1D区域序列设计引物探针对标准品进行定量研究。引物探针序列见表1。

1.5 口蹄疫病毒As-1／PK-1／2005的1nt～2208nt片段和3012nt～5155nt片段的扩增、克隆和序列分析 设计引物扩增As-1／PK-1／2005的2个基因片段。引物序列见表2。

表1 荧光RT-PCR引物探针序列

表2 扩增口蹄疫病毒As-1／PK-1／20051nt～2208nt片段和3012nt～5155nt片段的引物名称、序列

对扩增产物进行纯化后，克隆入TaKaRa公司的pMD20-T载体，挑取出多个克隆依次进行PCR鉴定、酶切鉴定、测序，逐步筛选出正确的克隆。

1.6 SP6体外转录病毒RNA 对上述重组质粒序列进行分析，选用Bam HⅠ进行完全酶切，可以切出含SP6启动子的先行化DNA片段。用RiboMAXTMLarge Scale RNA Production Systems-SP6试剂盒进行体外转录。产物中加入DNase除去其中的DNA模板后，然后用Trizol法重提RNA，将得到的RNA沉淀溶于1.0mL的无RNA酶的灭菌水中，分装，20μL／管，冻存于-80℃下，即得到制备好的2种RNA片段。

1.7 标准品制备与初步定值 取制备的两种体外转录RNA，用DEPC水分别作200倍稀释，测定其260 nm和280nm的吸光度值（A260和A280），并通过计算其比值来衡量物质的纯度。根据测序结果，利用DNAMAN（Version 6）得出单链模板的分子量（MW）。按照下面公式计算初步拷贝数［7］：拷贝数＝A260×40×200×微升数×10-9×6.02×1023次／MW

根据计算结果，对两个片段分别应用稀释液（Trizol∶水＝3∶1）稀释至1×109copies／μL。将制备的两种RNA进行等体积混合，然后进行分装，100μL／管。

1.8 均匀性检验 随机抽取10管标准品，应用表1引物探针在重复条件下在2次试验中分别测试这10份RNA样品，手动设置基线，获取Ct值。结果数据用单因子方差分析进行统计处理。

1.9 稳定性检验 选择1nt～2208nt片段作为目标进行稳定性检验。随机抽取制备的标准品，在以下每种条件下放置10支：（1）室温20℃～25℃，相对湿度20%～50%，14d取出进行测试。（2）冰箱冷藏温度2℃～8℃，6个月取出进行测试。（3）-20℃，1年后取出进行测试。（4）对照，-80℃，长期放置。

对制备的pMD20-T-FMDV（1nt～2208nt）计算其拷贝数，进一步系列稀释制成一系列外标品。随机抽取按上述条件处理后的标准品，应用建立的口蹄疫病毒亚洲Ⅰ型荧光RT-PCR方法来间接测定重新提取的RNA的拷贝数。采用两样本均数显著性检验-t检验进行统计分析。

1.10 标准品协作标定 采用委托8家外部实验室协作标定的方法来对制备的标准品进行定值。分别对制备的pMD20-T-FMDV（1nt～2208nt）、pMD20-T-FMDV（3012nt～5155nt）计算其拷贝数，进一步系列稀释制成一系列外标品。应用建立的口蹄疫病毒通用荧光RT-PCR方法（针对5′NCR和2B）来间接测定标准品的拷贝数。

1.11 不确定度分析 通过对实际检测过程进行分析，确定标准品的总不确定度，进行评定。

2 结果与分析

2.1 口蹄疫病毒亚洲Ⅰ型1nt～2208nt片段和3012nt～5155nt片段的扩增、克隆和序列分析 采用表2的引物，成功扩增了口蹄疫病毒亚洲Ⅰ型的1nt～2208nt片段和3012nt～5155nt片段，并克隆入pMD20-T载体，见图1。分析序列选取XbaⅠ、Ecor lⅠ对1nt～2208nt片段和PstⅠ对3012nt～5155nt片段酶切鉴定正确，见图2。

对正确的克隆进行测序，选取序列正确的克隆命名为 pMD20-T-FMDV（1nt～2208nt）、pMD20-T-FMDV（3012nt～5155nt）。

2.2 SP6体外转录病毒RNA 用Bam HⅠ酶切上述质粒，均能切出含SP6启动子和目的DNA的片段。线性化后进行体外转录获得大量的2种RNA片段，纯化溶于1.0mL的无RNA酶的灭菌水中，分装为20μL／管，共50管，冻存于-80℃中。

2.3 标准品制备与初步定值 制备的2种RNA进行200倍稀释后，其A260和A280的比值均在1.9±0.1范围内，表明RNA纯度较高。初步计算，1nt～2208nt片段拷贝数为3.081×1011copies／μL；3012nt～5155nt片段拷贝数为1.274×1011copies／μL。分别稀释至1×109拷贝数／μL进行等体积混合分装，100μL／管，共800管，冻存于-80℃中。

2.4 均匀性检验结果 对随机抽取10管标准品测试后数据分析见图3，图4和表3。

按F临界值F0.05（9、10）＝3.14。计算的F值分别为2.99和1.45，该值＜F临界值，这表明在0.05显著性水平时，样品中目的核酸片段含量是均匀的。样品间变异系数CV%＝，分别为2.17%和2.03%，均小于5%。

2.5 稳定性检验结果 选择1nt～2208nt片段作为目标进行稳定性检验。将检测组与对照组（-80℃）数据分别作两样本均数显著性检验-t检验进行统计分析，结果见表4，表明检测组与对照组差异均无统计学意义（P＞0.05）。

表3 标准品均匀性试验方差分析结果

2.6 标准物质协作标定结果 采用委托8家外部实验室协作标定的方法来对制备的标准品进行定值。经统计分析，取平均值作为定值结果，结果见表5。

2.7 不确定度分析 标准品的总不确定度包括：分析测定误差、RNA提取过程的误差和样本不均匀性引起的误差。根据我国对于标准物质管理法规［8］定值结果表示方法，可以通过A类评定方法［9］进行评定。协作标定的标准差涵盖了以上不确定度分量。因此可作为本批标准品2个基因片段的不确定度（见表5）。

3 结语与讨论

目前市场上有许多口蹄疫病毒核酸检测试剂，但缺乏评价和验证。根据文献，5′NCR、2B和1D区域为目前常用口蹄疫病毒核酸检测方法的检测区域。因此，选用可以完全包含以上区域的1nt～2208nt和3012nt～5155nt2个片段来制备RNA标准物质。RNA极易降解，我们选择商品化的RNA提取裂解液Trizol作为基质分散RNA，结果表明其均匀性及稳定性效果均很好。

多项结果分析表明，本研究制备的标准物质可以在实际生产中作为参比品应用于目前检测方法的评价和验证，对逆转录和PCR扩增2个方面进行质量控制，同时用来规范用于检测的试剂和实验室的质量，消除不同人员操作间的差异，为量值传递提供参比品，具有实用性和适用性。

表4 标准品t检验统计结果

表5 标准品协作标定结果

人医的某些疾病中已应用我国自己的核酸检测标准物质，使我国定量检测缺乏统一标准，结果没有可比性的现状有了很大改进。而动物疾病标准物质的研究还趋于空白，造成检测结果存在10～100倍的差异。因此，制备标准物质用于检测方法的标准化已经是目前检测动物疾病规范化的一个重要趋势。

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