HPLC法测定胎盘灌流液中安替比林浓度Δ

吴晖，孙谷韵，姚勤，周琼，邓杨林，黄桦，张峻#（.昆明医学院第一附属医院临床药学中心，昆明 65003；.昆明医学院，昆明 65003）

离体胎盘灌注技术将刚分娩出的胎盘进行小叶分离、灌注并建立胎儿母体双循环模型，在体外模拟人体子宫，为原来无法在孕妇体内完成的胎盘透过性研究提供了一种可行的途径。该技术目前已成为研究外来物质（如药物、毒物、环境污染物等）能否透过胎盘、对胎儿造成暴露的经典技术[1～3]。安替比林是一种解热镇痛药，因其对胎盘具有稳定的透过性，成为了应用离体胎盘灌注技术研究胎盘透过性的质量控制指标。其胎盘透过率是胎盘膜转运功能的特异性指标，是评价离体胎盘灌流是否成功、是否可用于胎盘透过性研究的关键[4]。本文建立了专属性强、灵敏度高的药物分析方法测定胎盘灌流液中安替比林浓度，以便准确计算安替比林胎盘透过率，保证离体胎盘灌注技术的质量控制。

1 材料

1.1 仪器

高效液相色谱系统，包括600二元泵、717自动进样器、2996二极管阵列检测器（美国Waters公司）；AL104-IC型电子分析天平（美国梅特勒-托利多公司）；CHN868系pH计（美国梅特勒-托利多公司）；80-2B离心机（上海安亭科学仪器厂）；ZH-2自动涡旋混合器（天津药典标准仪器厂）；MTN-2800D氮吹浓缩仪（天津奥特塞恩斯）。

1.2 试药

安替比林标准品（中国食品药品检定研究院，批号：100506-200301）；内标：非那西丁标准品（瑞士Fluka公司，批号：S3270413806B18）；牛血清白蛋白（BSA，美国Roche公司，批号：10735078001）；Krebs-Ringer Bicarbonate Buffer干粉（美国Sigma公司，批号：029K08）；甲醇为色谱纯，水为超纯水，其余试剂为分析纯。

2 方法与结果

2.1 色谱条件

色谱柱：Waters Symmetry C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流动相：甲醇∶0.05 mol·L－1磷酸氢二钠缓冲液（用氢氧化钠调节pH为6.5）＝70∶30；流速：1 mL·min－1；进样量：20 μL；检测波长：254 nm；柱温：35℃。

2.2 溶液的制备

准确称取安替比林标准品25.0 mg于25 mL容量瓶，加甲醇稀释至刻度得1 000 mg·L－1标准贮备母液，2～8℃储存备用。准确称取非那西丁标准品（内标）5.0 mg于50 mL容量瓶，加甲醇稀释至刻度得100 mg·L－1标准液，2～8℃储存备用。胎盘灌流液按Shintaku等的方法[5]进行配制，即称取0.95 g Krebs-Ringer Bicarbonate Buffer干粉于70 mL纯水溶解，再加入碳酸氢钠0.126 g充分溶解后加入肝素2 500 u、2支80万u青霉素、低分子右旋糖酐铁5 mL充分混匀，最后加纯水至100 mL，现配现用。

2.3 样品处理

将新配制含药样品（即新鲜配制的胎盘灌流液加入适量安替比林标准溶液）0.5 mL与内标（100 mg·L－1非那西丁）溶液50 μL，于离心试管中混合均匀，再加入三氯甲烷2 mL，涡旋混匀1 min后，4 000 r·min－1离心10 min，吸取有机相于干净离心管中，35～40 ℃空气流吹干。甲醇200 μL复溶30 s，取20 μ L进样分析。

2.4 标准曲线的制备

精密加入安替比林标准溶液适量于空白胎盘灌流液中，使药物浓度分别为20、16、10.24 、8.192、4.194 、2.147 、1.095 mg·L－1，与内标（100 mg·L－1非那西丁）溶液50 μL混合均匀，按“2.3”项下方法处理后按“2.1”项色谱条件进样测定，记录色谱。以安替比林浓度（c）对安替比林与内标的峰面积比值（A）进行线性回归，得标准曲线方程为：A＝0.006 4c－0.011 2（r＝0.999 6），结果表明，安替比林检测浓度在1.095～20 mg·L－1范围内线性关系良好，测定方法的定量下限为1.095 mg·L－1，RSD为8.73%（n＝5）。

2.5 专属性考察

按“2.1”项下色谱条件，考察安替比林和非那西丁在胎盘灌流液的色谱行为，并与安替比林和非那西丁标准品进行比较。结果，安替比林和内标的保留时间分别为4.5 min和14.3 min，二者峰形良好，分离完全，无杂质峰干扰。色谱图见图1。

图1 高效液相色谱图A.空白胎盘灌流液；B.安替比林标准品；C.非那西丁标准品；D.胎盘灌流液样品；1.安替比林；2.非那西丁Fig 1 HPLC chromatogramsA.blank placental perfusion；B.antipyrine standard；C.phenacetin standard；D.placental perfusion sample；1.antipyrine；2.phenacetin

2.6 方法精密度与回收率试验

配制低、中、高3种浓度（2.147、8.192、16 mg·L－1）的灌流液质控样品，按“2.1”项下色谱条件进行分析，同日内制备各浓度并测定5个样品，在不同日连续制备并测定5个分析批，计算日内、日间精密度及方法回收率。回收率及精密度试验结果见表1。

表1 回收率及精密度试验结果Tab 1 Recovery and precision test results

2.7 稳定性考察

将安替比林和内标非那西丁的标准溶液于4℃环境下保存放置，在不同时间内（24 h、7 d、14 d、30 d）测定含量，结果偏倚≤4.17%，RSD＝0.69%，表明标准溶液在4℃环境下保存30 d性质稳定。灌流液样品在－20℃冰箱冷冻保存，在不同时间内（24 h、3 d、7 d）测定含量，结果偏倚均≤8.3%，RSD＝1.53%，表明灌流液样品在－20℃冰箱冷冻保存性质稳定。质和结构特征，分别比较了乙酸乙酯、乙醚、三氯甲烷等溶剂的萃取效果，结果以三氯甲烷的除杂质能力最强，同时提取回收率较高。故采用三氯甲烷进行液-液萃取的方法制备样品。该方法操作简便，可适用于国内大多数实验室的工作条件，为安替比林胎盘透过率的测定提供了简便、经济的药物分析方法。

3 讨论

安替比林是应用离体胎盘灌流技术研究胎盘透过性的质量控制指标。近年来国外研究者多数应用高效液相色谱法测定胎盘灌流过程中安替比林的浓度变化来计算安替比林胎盘透过率[4～6，7]，以便评价离体胎盘灌流是否成功。国内目前尚无测定胎盘灌流液中安替比林的方法学报道，本研究中笔者首次对胎盘灌流液介质中的药物分析方法进行探索。

胎盘灌流液成分复杂，含有无机离子、矿物元素、葡萄糖、激素、蛋白质等多种成分。国外文献报道多为高效液相色谱法，其将胎盘灌流液样本经不同试剂多次蛋白沉淀后，高速离心取上清液进样[8，9]。这种方法处理过程较为复杂，不仅因多次沉淀降低了样品浓度，增加了检测难度，并且对离心速度要求较高，试验条件较难达到。本研究针对灌流液成分理化性

[1]Myren M，Mose T，Mathiesen L，et al.The human placenta an alternative for studying foetal exposure[J].Toxicol Vitro，2007，21（7）：1 332.

[2]Balakrishnan B，Henare K，Thorstensen EB，et al.Transfer of bisphenol A across the human placenta[J].Am J Obstet Gynecol，2010，202（4）：393.

[3]Balakrishnan B，Thorstensen EB，PonnampalamAP，et al.Transplacental transfer and biotransformation of genistein in human placenta[J].Placenta，2010，31（6）：506.

[4]Mathiesen L，Mose T，Morck TJ，et al.Quality assessment of a placental perfusion protocol[J].Reproductive Toxicology，2010，30（1）：138.

[5]Shintaku K，Arima Y，Dan Y，et al.Kinetic analysis of the transport of salicylic acid，a nonsteroidal anti-inflammatory drug，across human placenta[J].Drug Metabolism and Disposition，2007，35（5）：772.

[6]NemmarA，Hamoir J，Nemery B，et al.Evaluation of particle translocation across the alveolo-capillary barrier in isolated perfused rabbit lung model[J].Toxicology，2005，208（1）：105.

[7]Gedeon C，Behravan J，Koren G.Transport of glyburide by placental ABC transporters：implications in fetal drug exposure[J].Placenta，2006，27（11）：1 092.

[8]Line M，Erik R，Tina M，et al.Transport of benzo[α]pyrene in the dually perfused human placenta perfusion model：effect of albumin in the perfusion medium[J].Basic&Clinical Pharmacology&Toxicology，2009，105（3）：181.

[9]Myllynen PK，Pienimäki PK，Vähäkangas KH.Transplacental passage of lamotrigine in a human placental perfusion systemin vitro and in maternal and cord blood in vivo[J].Eur J Clin Pharmacol，2003，58（10）：677.