担载丝裂霉素纳米纤维对膀胱移行细胞癌T24细胞增殖的抑制作用及对细胞周期相关蛋白的影响

岳 鑫 岳 磊 王 丽 (解放军第208医院，吉林 长春 30062)

膀胱癌是泌尿系统中最常见的恶性肿瘤，不论是发病率还是死亡率均占泌尿系统肿瘤的首位。近年来膀胱癌的发病率有上升趋势，多数为移行上皮细胞癌。膀胱移行细胞癌的特点是发病率高、复发率高、治疗复杂。低剂量丝裂霉素(MMC)化疗不但可提高疗效，且减轻毒副作用，与常规化疗剂量方案比较，其增效减毒作用显著。本研究以生物降解高分子材料丙交酯己内酯共聚物(PLCL，LA/CL 80∶20，SFDA认证)为载体制备了新剂型，为验证纳米纤维剂型MMC对膀胱癌细胞的生物学活性，探讨其作用机制。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 细胞株 人膀胱移行细胞癌细胞株T24购自武汉博士德公司。

1.1.2 可生物降解MMC纳米纤维片 采用电纺丝技术制备载有MMC生物降解丙交酯/己内酯共聚物纳米纤维。药物担载浓度为5%(质量百分比浓度)。MMC购于浙江海正药业股份有限公司(纯度＞99%)。

1.2 方法

1.2.1 人工计数法 所选T24细胞以4×105细胞/ml制备细胞悬液;然后选用24孔培养板接种细胞。将担载MMC的可生物降解载药纳米纱布剪成不同质量的小片，分别为2、4、8 mg，加入不同质量的小片于T24细胞的培养板孔中，日消化细胞3复孔，消化时间为第1、2、3、4、5 天，台盼蓝染色后，使用光学纤维镜及血细胞计数板对受试细胞进行计数。

1.2.2 四唑盐(MTT)比色法 选用生长状态良好的T24细胞，用0.25%胰酶消化为单细胞悬液，调整浓度至5×104/ml，接种于96孔培养板内，每孔200 μl，培养24 h后，加入不同重量的担载MMC的纳米纤维(质量分别为1、2、4、8 mg)，同时需设对照组。每组做3复孔。培养12、24、36、48 h和72 h后取出置96孔细胞培养板，在每孔内加入 20 μl MTT(浓度20 mg/ml)，放入培养箱内继续培养;4 h过后，将培养板取出，将细胞内MTT与线粒体酶发生反应后形成的蓝紫色结晶物于倒置光学显微镜下进行观察;上清液弃掉，每孔内加入150 μl二甲基亚砜(DMSO)，水平摇床振荡10～15 min;用酶标仪在490 nm波长下测定其吸光度(OD)值。细胞存活率公式:给药组OD/对照组OD×100%。

1.2.3 Western印迹检测各种蛋白表达 T24细胞铺板:取传代后状态好的细胞接种于直径6 cm培养皿中，将其放于5%CO2，37℃的饱和湿度培养箱，时间为24 h。药物处理培养细胞:吸除培养液后，加入不同重量的(2、4 mg和8 mg)担载MMC的纳米纤维，持续培养细胞48 h。刮取不同质量组别细胞，对细胞的总蛋白进行提取并定量后，对(1)细胞周期素依赖激酶(cyclin dependent kinase4，CDK4);(2)细胞周期素依赖性激酶抑制剂-1(WAF1/p21);(3)细胞周期蛋白(cyclin D1)的含量变化进行研究，Western印迹检测后，用底片扫描仪扫描X光胶片，通过凝胶成像系统对目的电泳条带进行解读，并通过Bandscan软件进行密度扫描。对照抗体见表1。

表1 抗体稀释浓度表

2 结 果

2.1 担载MMC的纳米纤维片对T24细胞增殖的抑制作用细胞计数法与空白对照组相比，2、4、8 mg的担载MMC的纳米纤维在24 h后都显著地降低了T24细胞数目。以72 h为例，由525×104个/ml分别降低为470×104个/ml(2 mg)、425×104个/ml(4 mg)和350×104个/ml(8 mg)。见图1。

图1 担载MMC的纳米纤维片对T24细胞数目的影响

2.2 MTT比色法检测担载MMC的纳米纤维片对T24细胞增殖的抑制作用 经担载MMC的纳米纤维片处理3 d的T24细胞OD值显著下调，并以剂量-时间依赖的方式，存在显著性差异(P＜0.05)。见图2。

图2 担载MMC的纳米纤维片对T24细胞增殖的抑制作用

2.3 担载MMC的纳米纤维片对T24细胞周期相关蛋白的影响

担载MMC的纳米纤维以剂量依赖方式显著升高了WAF1/p21的表达，而使CDK4和cyclin D1的表达降低。见图3。

图3 担载MMC的可生物降解载药纳米纱布片对T24细胞WAF-1/p21、Cyclin D1和Cdk4含量的影响

3 讨论

MTT比色分析法不仅操作简单，而且实验结果的可靠性高，故而可作为了解药物与肿瘤细胞之间作用机制研究的手段之一。本文通过对比担载MMC的可生物降解载药纳米纤维对照组和药敏组肿瘤细胞的数量，可以检测出药物对肿瘤细胞的生存率所产生的影响。T24细胞作为多种实验中测试的肿瘤细胞样本，用途广泛，来源于老年白人女性，20 h为其细胞倍增时间〔1〕，但作为担载MMC纳米纤维的受试细胞(膀胱癌T24细胞)，研究者们未曾涉足。本实验结果显示，担载MMC的纳米纤维片可以显著地抑制T24细胞增殖，并且为时间-浓度依赖性方式。

p53在转录水平上能够激活WAF-1/p21。在由p53调控的因DNA损伤而使细胞停顿于G1期的反应中，p21发挥效应基因的作用;p21可结合和抑制增殖细胞核抗原(PCNA)，进而抑制DNA的复制及DNA多聚酶，使损伤的DNA在复制前修复功能。在G1期发挥调控作用的主要是cyclin D及其结合分子CDK4 和 CDK6〔2～4〕。cyclin D1-CDK4-pRb 通路在细胞由 G1期跃迁至S期起到关键作用。cyclin D1和CDK4被证实在肿瘤的发生中起重要作用，并被认为可能是判断肿瘤预后的重要因子和治疗靶点〔5，6〕。

本实验的重点研究领域是检测下述各项指标:WAF-1/p21，CDK4，cyclin D1。结果表明:担载MMC的可生物降解载药纳米纱布片以剂量依赖的方式显著地提高WAFl/p21表达，而使CDK4及cyclin D1蛋白表达下降。结合本研究考虑，担载MMC的纳米纤维片可使G1期阻滞，其原因可能是其上调了WAF1/p21的表达，下调了CDK4和cyclin D1的表达。

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