紫龙金片对吉非替尼引起Caco-2细胞通透性增加的抑制作用

王 原 余亮科 房 芳 赵 辉 潘 涛 杜改萍

(河北联合大学附属医院消化科，河北 唐山 063000)

吉非替尼(Gefitinib)是一种选择性表皮生长因子受体酪氨酸激酶抑制剂，可妨碍肿瘤的生长、转移和血管生成，并增加肿瘤细胞的凋亡。目前吉非替尼主要用于治疗中晚期或转移性非小细胞肺癌(NSCLC)，但有一定的毒副作用，包括胃肠道反应，如恶心、呕吐及腹泻等，一定程度上影响患者的生活质量〔1〕。有报道称中药紫龙金片能在一定程度上减轻化疗的副作用〔2〕。本研究拟探讨紫龙金片能否通过抑制吉非替尼诱发的肠道通透性增加而改善胃肠道反应。

1 材料与方法

1.1 实验材料 电阻仪ESR-001(密理博，北京);结肠腺癌细胞Caco-2细胞株(购自中国医学科学院基础医学研究所);胎牛血清(Gibco，美国);Transwell培养板(Cornig，美国);甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAPDH)抗体、核转录因子(NF)-κB p65抗体(美国Santa Cruz公司)。

1.2 方法

1.2.1 构建肠上皮细胞屏障模型 Caco-2细胞株培养于含有10%胎牛血清、10 g/L非必需氨基酸、10 g/L谷氨酰胺和青霉素-链霉素双抗液的DMEM完全培养基，在37℃、5%CO2条件下培养，3 d可基本融合。将Caco-2细胞接种于Transwell板上(孔径0.8 μm)，接种密度为1×104/cm2，隔日换液，直至形成紧密单层，用于后续实验。

1.2.2 制备药品原液 吉非替尼(250 mg/片)研磨制成粉末，溶于DMEM培养基，配制成250 μg/ml的药物原液;紫龙金片(0.65 g/片)制成粉末，溶于DMEM培养基配制成650 μg/ml的药物原液，置于－20℃保存，实验前用无血清DMEM培养液稀释成所需浓度。

1.2.3 分组 待Caco-2细胞成紧密单层后，做同步化培养。然后将其分为:正常对照组(组1)、吉非替尼组(组2)和紫龙金片联合吉非替尼组(组3)，组2、组3根据预处理时间又分为12、24 h亚组。各亚组于相应时间点在Transwell基底侧加入吉非替尼(250 μg/ml)、紫龙金片(650 μg/ml)分别孵育 12、24 h。

1.2.4 跨上皮细胞电阻(TEER)的测定 参照文献〔3，4〕，应用电阻仪测定各组Caco-2细胞的TEER，整个过程在恒定温度下(37℃)进行，每个Transwell培养环境下取不同方向的3个点，重复测定3次，取均值乘以培养板膜面积，即为该样品的TEER值，以Ω·cm2示。

1.2.5 Western印迹检测NF-κB p65蛋白水平的表达 收集各组细胞，加裂解液冰上裂解，12 000 r/min离心10 min，取上清测定浓度后－80℃保存备用。十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶(SDS-PAGE)电泳分离，完毕后将蛋白转移到聚偏氟乙烯(PVDF)膜上。5%脱脂奶粉封闭，后放入含一抗的Tris盐酸缓冲液(TBST)，4℃过夜，洗膜，然后用辣根过氧化物酶标记的二抗室温反应1 h，目标蛋白质用二氨基联苯胺(DAB)显色。计算机扫描，以GAPDH蛋白做参照，分析处理。

1.3 统计学处理 应用SPSS17.0软件进行分析，数据以±s表示，采用配对t检验或单因素方差分析(AVONA)。

2 结果

2.1 各组细胞的TEER 组2、组3各亚组Caco-2细胞TEER值均降低，与组1比较有统计学差异(均P＜0.05)，其中组2 24 h亚组TEER降至最低，与组2、组3其余亚组比较均有统计学意义，组3 24 h亚组TEER值较组3同时间上升明显(均P＜0.05)。见图1。

2.2 Western印迹检测各组细胞NF-κB p65蛋白的表达情况组2、组3的NF-κB p65蛋白表达量升高，与组1比较有统计学意义(P＜0.05)，组3各亚组间NF-κB p65蛋白含量较组2低(P＜0.05)。见图2。

图2 不同处理组NF-κB p65蛋白表达变化

3 讨论

肠黏膜上皮屏障完善与否是肠道系统稳态的重要影响因素〔4〕。NF-κB信号转导途径是细胞内重要的信号转导通路，在细胞的凋亡、存活、增殖中发挥重要的调节功能，并且参与维持细胞对各种刺激的应答过程〔5〕。

有研究表明，化疗和吉非替尼引起的胃肠道反应，一定程度上与肠道上皮细胞通透性增加有关〔6〕。本实验发现吉非替尼可损伤Caco-2细胞屏障功能，导致其通透性增加;加用紫龙金片后通透性降低，提示紫龙金片有保护细胞屏障功能的作用。同时还可发现 NF-κB p65蛋白量增加，加用紫龙金片后蛋白表达量减少，推测吉非替尼损伤肠上皮细胞通透性可能与激活NF-κB通路有关，而紫龙金片可能作用于这一通路，以降低细胞间通透性。

图1 各组不同时间Caco-2细胞通透性变化

1 van Erp NP，Gelderblom H，Guchelaar HJ.Clinical pharmacokinetics of tyrosine kinase inhibitors〔J〕.Cancer Treat Rev，2009;35(8):692-706.

2 汪 江，颜维仁.紫龙金片配合化疗治疗中晚期非小细胞肺癌的研究〔J〕.现代中西医结合杂志，2008;17(1):3-5.

3 王国丽，尹菁华，毛定安，等.TNF-α体外对Caco-2细胞通透性的影响及其机制〔J〕.世界华人消化杂志，2010;18(9):942-6.

4 Schmitz H，Fromm M，Bentzel CJ，et al.Tumor necrosis factor-alpha(TNFalpha)regulates the epithelial barrier in the human intestinal cell line HT-29/B6〔J〕.J Cell Sci，1999;112(1):137-46.

5 Pasparakis M.Regulation of tissue homeostasis by NF-kappaB signalling:implications for inflammatory diseases〔J〕.Nat Rev Immunol，2009;9(11):778-88.

6 Melichar B，Dvorák J，Kalábová H，et al.Intestinal permeability，vitamin a absorption and serum alpha-tocopherol during therapy with gefitinib〔J〕.Scand J Clin Lab Invest，2010;70(3):180-7.