清心开窍方皂苷对阿尔茨海默病大鼠学习记忆能力的影响及其机制

朱未名 胡海燕 陈 翔 毛丹丹 叶光华 (温州鹿城精神病医院，浙江 温州 325003)

阿尔茨海默病(AD)发病率随年龄增长而不断增加，已成为继心脏病、肿瘤和脑卒中之后的第四位死亡原因，给家庭和社会带来很大负担。中医对AD的治疗有上千年的历史，积累了丰富的经验。本文探讨清心开窍方皂苷对AD模型大鼠学习记忆能力和海马区神经胶质细胞原纤维酸性蛋白(GFAP)及Aβ表达的影响。

1 材料与方法

1.1 动物及药物 SPF级SD大鼠40只，雄性，体重(250±20)g，由湖南斯莱克景达实验动物有限公司提供〔许可证号:SCXK(湘)2009-0004〕。Aβ25～35由北京博奥森生物技术有限公司生产。清心开窍方由生地、麦冬、白芍、石斛、丹皮、茯神、陈皮、知母、石菖蒲等组成(湖南中医药大学附属第一医院药剂科提供)。盐酸多奈哌齐(安理申)由卫材(中国)药业有限公司生产(批号:100223A)。

1.2 试剂与仪器 GFAP、Aβ、淀粉样前体蛋白(APP)、白介素(IL)-1β免疫组化试剂盒、SABC试剂盒、DAB显色剂由武汉博士德生物工程有限公司提供。BMJ-1生物组织包埋机(天津航空机电公司)。Shandon325型石蜡切片机(英国Shandon公司)。DNP-9162型电热恒温培养箱(上海精宏实验设备有限公司)。LEICA DM LB2型双目显微镜(德国LEICA公司)。Motic B5显微摄像系统(麦克奥迪实业集团公司)。MIAS医学图像分析系统(北航公司)。

1.3 方法

1.3.1 清心开窍方总皂甙成分的提取 清心开窍方经水提醇沉法得到初提药液，然后采用乙醚、乙酸乙酯、正丁醇等提取分离，得到含70%总皂甙成分的清心开窍方制剂〔1〕。

1.3.2 造模方法 聚集态Aβ25～35的准备:按说明书配置，4℃冰箱保存备用。AD的模型制造参照文献方法〔2～4〕进行。除正常组外，其余各组均将Aβ25～35注入大鼠双侧杏仁核，通过Aβ的神经毒作用，造成类AD模型。

1.3.3 动物分组及给药方法 经环境适应性饲养1 w后，于造模前进行水迷宫训练3 d，剔除差异明显者。称体重后按随机数字表分为7组:正常组、模型组、清心开窍方组(清开组)、皂苷组及安理申组，每组8只。依标准动物体质量法，清心开窍方组、皂苷组及安理申给药分别相当于60 kg成人用药的20倍。于造模后第2天灌胃，每天1次，其余各组用等量的双蒸水灌胃，连续2 w，水迷宫测试期间，于测试前30 min给药。

1.3.4 行为学检测方法 采用Morris水迷宫法。全部给药结束后开始水迷宫测试，在水池中注入清水，水面高出平台2 cm，水温控制在(21±1.5)℃。平台置于某一象限中间，在其他3个象限中任选一入水点，将大鼠面向池壁放入水中，观察并记录大鼠在水中游泳寻找并爬上平台的路线图、所需的时间(即潜伏期)，潜伏期的时间长短作为学习记忆能力的指标。设定最长游动时限为60 s，如果大鼠在60 s内未找到平台，需将其引至平台并停留10 s以强化记忆，这时所需时间记为60 s。每天训练2次，连续5 d。第6天撤除平台，记录大鼠在1 min内跨越平台相应位置的次数，作为空间探索能力的指标。

1.3.5 标本制备方法 第15天处死动物，冰台上迅速取出脑组织，分离海马，放入4%多聚甲醛固定液中固定，将固定好的大脑组织取出，室温下经梯度酒精脱水(70%A→80%A→95%AⅠ→95%AⅡ→100%AⅠ→100%AⅡ)，二甲苯透明，浸蜡，石蜡包埋，备用。

1.3.6 免疫组织化学检测方法 石蜡切片厚5 μm，裱于用APES处理过的载玻片上，置45℃温箱内烤片24 h。切片常规脱蜡至水。滴加 3% H2O2室温孵育 10 min，蒸馏水洗2 min/次×3。热修复抗原10 min，PBS洗2 min/次×3。滴加正常山羊血清封闭液，室温孵育10 min，甩去多余血清。滴加特异性抗体，置湿盒内4℃冰箱过夜，PBS洗3 min/次×3。滴加生物素化 IgG，置湿盒内37℃温箱内孵育20 min，PBS洗3 min/次×3。滴加链霉亲和素-过氧化物酶，置湿盒内37℃温箱内孵育20 min，PBS洗3 min/次 ×3。DAB 显色5～10 min，蒸馏水洗。苏木素轻度复染，蒸馏水洗。常规脱水、二甲苯透明、树脂胶封固，显微镜观察。采用图像分析系统，每组选取6张切片，每张切片随机观察5个视野，精确选取视野内所有阳性颗粒，计算机自动算出面密度。面密度就是阳性目标总面积和统计场总面积之比，用于定量表达免疫组化阳性反应程度。

1.4 统计学方法 采用SPSS16.0统计软件处理，实验数据以±s表示，多个样本均数比较采用单因素方差分析，组间方差分析用F检验，有差异的组间两两比较用SNK-q检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 大鼠学习记忆能力和空间探索能力比较 各组大鼠潜伏期第1天、第2天无显著性差异(P＞0.05)，随着训练天数的增加各组大鼠潜伏期均缩短，模型组与正常组相比潜伏期明显延长，且第6天跨越平台的次数减少(P＜0.01);模型组与清开方组和安理申组相比有极显著性差异(P＜0.01);与皂苷组相比，差异亦有显著性(P＜0.05)。见表1。

表1 各组大鼠潜伏期比较(±s，s，n=8)

表1 各组大鼠潜伏期比较(±s，s，n=8)

与模型组比较:1)P＜0.05，2)P＜0.01;下表同

组别 第1天 第2天 第3天 第4天 第5天 第6天正常组 52.52±12.02 45.39±10.40 21.28±10.992) 17.87±7.112) 15.16±9.022) 3.88±0.782)模型组 56.97±10.69 49.77±7.11 49.47±11.54 46.26±9.25 43.46±11.68 0.55±0.52清开方组 56.86±9.43 47.42±9.07 23.19±15.942) 21.39±6.792) 19.13±11.422) 2.80±1.612)安理申组 56.83±8.99 47.11±9.11 22.77±7.932) 19.24±12.522) 17.78±11.542) 2.90±1.192)皂苷组 55.76±9.50 48.06±6.93 35.55±10.841) 32.35±12.251) 29.82±12.511) 1.88±1.451)

2.2 大鼠大脑海马区GFAP及IL-1β表达水平比较 模型组与正常组相比，大鼠海马区GFAP表达明显增多(P＜0.01);清开方组、皂苷组与模型组相比，海马区GFAP表达均减少(P＜0.05);安理申组与模型组相比，海马区GFAP表达减少(P＜0.01)。海马区IL-1β表达清开方组与模型组比较明显降低，(P＜0.05)，与皂苷组比较无显著差异(P＞0.05)。见表2、图1、图 2。

2.3 大鼠海马区Aβ、APP表达水平比较 大鼠模型组与正常组相比，海马Aβ、APP表达均明显增多(P＜0.01);清开方组与模型组相比，海马Aβ、APP表达均明显减少(P＜0.01，P＜0.05);皂苷组与模型组相比，海马 Aβ、APP表达减少(P＜0.05)。见表3、图3、图4。

图1 各组大鼠海马区GFAP表达(SABC法，×400)

图2 各组大鼠海马区IL-1β表达(SABC法，×400)

图3 各组大鼠海马区Aβ表达(SABC法，×400)

表2 大鼠海马区GFAP、IL-1β表达水平比较(±s，n=6)

表2 大鼠海马区GFAP、IL-1β表达水平比较(±s，n=6)

面密度正常组 0.045 2±0.006 82) 0.057 8±0.002 12)组别 GFAP面密度 IL-1β模型组 0.086 3±0.011 6 0.110 6±0.009 4安理申组 0.047 4±0.004 52) 0.093 8±0.005 21)清开方组 0.068 5±0.007 71) 0.094 1±0.007 51)皂苷组 0.071 7±0.013 01)0.104 1±0.011 1

表3 大鼠海马区Aβ、APP表达水平比较(±s，n=6)

表3 大鼠海马区Aβ、APP表达水平比较(±s，n=6)

面密度正常组 0.038 3±0.001 72) 0.036 6±0.008 82)组别 Aβ面密度 APP模型组 0.080 0±0.010 1 0.085 7±0.012 1安理申组 0.068 4±0.003 51) 0.042 8±0.012 02)清开方组 0.042 1±0.004 62) 0.073 2±0.008 51)皂苷组 0.069 2±0.002 41) 0.074 5±0.005 31)

图4 各组大鼠海马区βAPP表达(SABC法，×400)

3 讨论

Aβ在脑内沉积是AD早期的主要病理变化〔5，6〕。Aβ来源于体内APP，含有KPI结构的APP可能通过抑制Aβ的降解增加局部Aβ的浓度。SP中除含有淀粉样蛋白外，还包括炎性细胞因子IL-1、IL-6等，提示慢性炎症和免疫反应参与了AD的病理过程。Aβ通过激活小胶质细胞，将急性反应转变成慢性炎症损伤，其机制可能是小胶质细胞膜上的受体复合物(CD36和CD47)与神经元周围沉积的Aβ发生相互作用，导致小胶质细胞活化、增殖，GFAP是星形胶质细胞的标志物。AD患者大脑中GFAP水平可提高8～16倍，在中枢神经系统受损伤时，星形胶质细胞转化为反应性星形细胞致体积增大，出现GFAP增多的特征，而过量分泌促炎因子，介导炎症损伤〔7〕。有研究表明IL-1β过度表达和释放是其始动环节，IL-1β可以上调小胶质细胞和星形胶质细胞表达促炎因子，诱导补体、氧自由基、NO、β-APP等生成增加，导致慢性炎症的形成和炎性产物的大量产生，各种高水平的炎性产物在AD病理损伤中产生不同的病理促进作用，并贯穿AD病理发展的整个过程〔8〕。

本实验所采用方药源自明代著名医学家张景岳《景岳全书》中的“蛮煎”，由生地、麦冬、芍药、石菖蒲、石斛、牡丹皮、茯神、陈皮、知母、去木通，加苦参而成，具有清心凉血开窍功效。课题组自2004年开始通过动物试验来阐释清心开窍方治疗AD的疗效与机制，结果显示，清心开窍方水煎剂能明显改善由AlCl3灌胃导致痴呆的AD小鼠学习记忆能力，降低AD小鼠脑组织中NO、NOS含量及Ache活性，降低氧自由基对机体的损伤，明显改善海马神经细胞的破坏〔9～12〕。

本研究在以往研究的基础上采用Aβ25～35双侧杏仁核注射法，通过Aβ的毒性作用制作AD大鼠模型，以清心开窍方及其总皂苷进行治疗，结果显示清心开窍方通过降低GFAP，减轻炎性反应，调节Aβ及βAPP代谢而改善AD大鼠学习记忆的能力，提示通过有效抑制脑内炎性反应，减少Aβ产生是清心开窍方治疗AD的重要机制之一。由于课题经费和时间所限，本研究中动物实验的标本数量不够多，观察周期比较短，而有关清心开窍方在改善钙代谢、抑制细胞凋亡以及提高神经营养因子保护作用等方面的研究没有进行具体分析，还有待下一步深入探讨。

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