原发性肾病综合征并发急性肾损伤患者血清及肾组织中NGAL的表达及意义

刘 静，李绍梅，薛 雯，温文龙，杨 林，杨万霞，王建荣

(河北医科大学第二医院肾内科，河北 石家庄 050000)

原发性肾病综合征(primary nephrotic syndrome，PNS)并发急性肾损伤(acute kidney injury，AKI)时临床表现为无诱因出现少尿、无尿、肾功能急剧恶化;肾脏病理常出现肾小管间质病变如急性肾小管坏死(acute renal tubular necrosis，ATN)。有些患者虽已出现ATN病理改变，但血肌酐仍然正常，依靠血肌酐常不能早期诊断急性肾损伤，故肾活检是诊断ATN的金标准，而肾活检是一项有创检查并且具有一定风险，因此寻找早期无创性和敏感性较好的AKI生物学标志物，对PNS并发AKI的早期诊断、治疗和改善预后有着重要意义。近年来已有大量研究表明中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白(neutrophil gelatinase－associated lipocalin，NGAL)是诊断急性肾损伤最有效的生物学标志之一。本研究通过检测PNS患者血清及肾组织中NGAL的表达水平，探讨血清和肾组织NGAL在PNS合并AKI时的作用和临床意义。

材料和方法

1 一般资料

选择符合原发性肾病综合征(诊断标准:尿蛋白＞3.5 g/24 h，血浆白蛋白 ＜30 g/L)的患者72例(男45例，女27例)，年龄18～76岁，平均(37.47±18.61)岁，所有患者均行肾活检病理检查，除外继发性肾病综合征及感染性疾病。肾活检前均未用过糖皮质激素、免疫抑制剂、抗凝剂、血管紧张素转换酶抑制剂等药物。根据肾脏病理有无急性肾小管坏死分为2组:(1)原发性肾病综合征合并急性肾小管坏死组15例(男8例，女7例)，其中微小病变(minimal change disease，MCD)合并急性肾小管坏死10例，系膜增生性肾炎(mesanginal proliferative glomerulonephritis，MsPGN)合并急性肾小管坏死5例;(2)原发性肾病综合征不合并急性肾小管坏死组57例(男37例，女20例)，根据病理类型分为MCD组24例(男16例，女8例)，膜性肾病(membranous nephropathy，MN)组23例(均为Ⅰ期MN，男15例，女8例)，MsPGN组10例(男6例，女4例)。正常对照组:血标本来自健康体检者15例(男8例，女7例)，平均年龄(32.86±1.18)岁;肾组织为肾脏肿瘤切除术后患者的正常肾组织5例(男3例，女2例)，平均年龄(41.67±15.71)岁。

2 方法

2.1 标本的采集和保存 (1)血标本:收集入选患者肾活检当天清晨空腹静脉血5 mL，3000 r/min离心10 min，取上清液存于－70℃备检。(2)肾组织标本:在B超引导、无菌操作下肾活检，标本经FAA复合固定液固定24 h，常规梯度浓度乙醇脱水，二甲苯中透明，浸蜡包埋，置于室温下保存备用。

2.2 血清NGAL检测方法 采用ELISA方法检测血清NGAL的水平，ELISA试剂盒购于美国GBD公司。

2.3 肾组织免疫组化染色检测NGAL表达 采用北航数码医学图像分析系统进行病理图像分析，在光学显微镜下放大200倍摄取图像，每张切片任意选取5个不含有肾小球的皮质视野，采用阳性目标表达指数(expression index，EI)(%)=阳性目标平均吸光度值×阳性面积/(阳性面积+阴性面积)×100%表示，取其平均值作为该切片的表达指标。兔抗人NGAL多克隆抗体购于博海生物工程开发有限公司。

2.4 生化指标测定 血尿素氮、血肌酐、血白蛋白和24 h尿蛋白定量采用Bayer ADVIA1650自动生化仪在我院生化室检测;血β2微球蛋白采用放射免疫法在我院核医学科检测。

3 统计学处理

数据采用SPSS 13.0统计软件处理，数据以均数±标准差()表示，多组间比较方差齐时采用单因素方差分析，方差不齐时采用秩和检验，各组间两两比较选择SNK法。NGAL与临床指标的相关性用直线相关分析。以P＜0.05为差异有统计学意义。

结 果

1 PNS患者血清NGAL水平

PNS患者血清NGAL水平明显高于正常对照组(P＜0.05)，PNS患者不同病理类型之间比较，MN组较MCD组、MsPGN组明显升高(P＜0.05)，MCD组与MsPGN组比较无统计学意义(P＞0.05)，见表1。

2 PNS患者肾组织NGAL的表达

PNS患者肾组织中NGAL阳性目标表达指数明显高于正常对照组(P＜0.05)，各病理类型之间NGAL表达无统计学意义(P ＞0.05)，见表1。

表1 PNS不同病理类型组患者血清NGAL水平和肾组织NGAL的表达Table1.The serum level and the renal expression of NGAL in PNS groups()

表1 PNS不同病理类型组患者血清NGAL水平和肾组织NGAL的表达Table1.The serum level and the renal expression of NGAL in PNS groups()

*P＜0.05 vs normal serum;△P＜0.05 vs MCD and MsPGN;#P＜0.05 vs normal renal tissue.

Group n Serum NGALRenal NGAL EI(μg/L)(%)MCD 24 67.75 ±21.94* 5.69 ±0.54#MN 23 92.67 ±29.83＊△ 5.47 ±0.66#MsPGN 10 73.72 ±24.06* 5.66 ±0.31#Normal serum 15 24.51 ±2.61 —Normal renal tissue 5 —3.16 ±0.69

3 PNS合并ATN与不合并ATN患者血清NGAL水平比较

MCD合并ATN组和MsPGN合并ATN组血清NGAL水平分别为(103.25±20.81)μg/L和(98.24±18.58)μg/L，明显高于不合并ATN组[(67.75±21.94)μg/L和(73.72±24.06)μg/L，P ＜0.05]，见表2。

4 PNS合并ATN与不合并ATN患者肾组织NGAL表达比较

MCD合并ATN组和MsPGN合并ATN组肾组织NGAL的阳性目标表达指数分别为(12.23±2.64)%和(14.68±3.80)%，明显高于不合并ATN组[(5.69±0.54)%和(5.66±0.31)%，P ＜0.05]，见表2、图1。

表2 MCD、MsPGN合并ATN组与不合并ATN组患者血清NGAL和肾组织NGAL水平的比较Table2.Comparison of the levels of NGAL in serum and renal tissues of PNS patents with or without ATN()

表2 MCD、MsPGN合并ATN组与不合并ATN组患者血清NGAL和肾组织NGAL水平的比较Table2.Comparison of the levels of NGAL in serum and renal tissues of PNS patents with or without ATN()

*P＜0.05 vs MCD without ATN and normol;#P＜0.05 vs MsPGN without ATN and normol.

Group n Serum NGAL(μg/L) Renal NGAL EI(%)Normal Serum 15 24.51±2.61─Renal 5 ─ 3.16±0.69 MCD With ATN 10 103.25±20.81* 12.23±2.64*Without ATN 24 67.75±21.94 5.69±0.54 MsPGN With ATN 5 98.24±18.58# 14.68±3.84#Without ATN 10 73.72±24.06 5.66±0.31

Figure1.NGAL expression in renal tissues(immunohistochemical staining，×100).A:normal renal tissue;B:MCD with ATN group;C:MCD group;D:MsPGN with ATN group;E:MsPGN group.图1 肾组织NGAL的表达

5 相关分析结果

血清中NGAL与24 h尿蛋白定量、血尿素氮和血肌酐呈正相关(P＜0.05)，与血清白蛋白和β2微球蛋白无明显相关性(P＞0.05)。血中NGAL与肾组织NGAL的表达呈正相关(P ＜0.01)，见表3。

表3 血清NGAL与临床指标或肾组织NGAL的关系Table3.Correlation between serum NGAL and clinical parameters or the expression of NGAL in renal tissues

讨 论

原发性肾病综合征并发急性肾损伤病因复杂，可以发生在疾病的任何阶段，各种病理类型均可发生，常发生于MCD和轻度MsPGN，但也可发生于其它病理类型如局灶节段性肾小球硬化(focal segmental glomerulosclerosis，FSGS)，多数为少尿型，急性肾小管间质损害是其病理学基础，且早于血肌酐升高，严重者可危及生命[1]。本研究结果显示72例肾病综合征中以血肌酐升高诊断急性肾衰竭5例，占6.90%，但病理诊断合并急性肾小管坏死15例，占20.27%，其中MCD合并ATN 10例，占66.70%，系膜增生性肾小球肾炎合并ATN 5例，占33.30%，与文献报道一致[2]。肾病综合征合并急性肾损伤机制尚不完全清楚，可能是由于低蛋白血症造成血容量不足，另外，白蛋白是尿蛋白的主要成分，可诱导肾小管上皮细胞增殖、凋亡或向成肌纤维细胞转化[3]，以及诱导表达一系列细胞因子，而且严重的蛋白尿可形成管型堵塞肾小管，肾间质水肿压迫肾小管导致其管腔狭窄、闭塞、造成肾小囊内压增高，而致肾小球滤过率进一步下降出现急性肾衰竭。

目前血肌酐和尿量改变仍是诊断急性肾损伤的依据，但血肌酐受年龄、性别、体重、容量负荷、肌肉代谢及蛋白摄入等非肾脏因素影响较大，结果并不可靠[4]，且血肌酐升高也不能反映肾脏损伤的部位，尿量更容易受到血容量状态、药物等非肾性因素影响。因此寻找早期的、敏感的、无创的标志物至关重要。新近研究表明可反映急性肾损伤的生物学指标有:半胱氨酸蛋白酶抑制剂C、肾脏损伤分子－1、NGAL、白细胞介素－18、尿－N－乙酰－β－D氨基葡萄糖苷酶、Na+/H+交换体等，NGAL是诊断急性肾损伤最有效的生物学标志之一。

NGAL是lipocalin家族的成员，NGAL蛋白由一条多肽链构成，分子量为25 kD，含有178个氨基酸残基，最早发现于粒细胞内，与中性粒细胞明胶酶共价结合，目前的研究已经证实NGAL蛋白可以运输疏水性小分子，参与细胞内铁离子转运、炎症反应和肿瘤细胞转移等。通常NGAL在人类一些组织(肾、肺、胃和结肠)中以很低的水平表达，在各种病理状态下由免疫细胞、肝脏细胞和肾小管上皮细胞表达和分泌，肾脏缺血或缺血性再灌注肾损伤后可引起小管升支粗段NGAL分泌迅速增加。NGAL不仅存在于尿液中，同样也存在于血浆中，因此它既能避免因极度少尿带来的麻烦，又能减轻因使用利尿药治疗等带来的干扰，所以血浆中NGAL浓度的测定对少尿型AKI的早期诊断将更加有价值。在肾脏发育过程中，间质细胞向上皮细胞的转化受NGAL诱导，并且NGAL有类似转铁蛋白的铁转运作用，主要被原始肾上皮细胞摄取，通过介导铁的转运来促进肾上皮细胞的成熟。

张玉晶等[5]发现在过敏性紫癜患儿血清NGAL水平随着尿蛋白排出增加而升高，大量蛋白尿组患儿血清NGAL水平明显高于正常对照组。肾组织中NGAL的表达，大量蛋白尿组明显高于正常对照组[6]。本研究结果中原发性肾病综合征患者血清NGAL较正常对照组升高，并且与蛋白尿显著相关，另外NGAL在正常肾组织及PNS患者肾组织近端肾小管上皮细胞胞浆均可表达，但在PNS患者肾组织中表达明显升高，表明血清NGAL可反映蛋白尿导致的肾小球损害，本研究结果显示血清NGAL在肾病综合征不同病理类型中以膜性肾病升高最明显，可能与肾病综合征不同病理类型蛋白尿发生机制不同有关，还有待于扩大样本量和临床更进一步研究证实。

研究发现在肾缺血再灌注损伤后3 h就能检测到NGAL，且在近端肾小管表达明显增强[7]。有学者建立大鼠肾脏缺血再灌注损伤模型，分别在缺血前1 h、缺血中或缺血后1 h给予大鼠250 μg NGAL，与对照组相比，NGAL不但能够明显降低大鼠血尿素氮和血肌酐水平，而且明显减少肾小管上皮细胞坏死，促进肾小管上皮的修复[8]。本实验结果显示原发性肾病综合征合并急性肾小管坏死时血清及肾组织中NGAL表达水平较不合并急性肾小管坏死时明显升高，与文献[9]报道一致，说明血NGAL的增高不仅可反映肾小球损害，还可以预测急性肾小管坏死，能够作为诊断早期急性肾损伤的敏感生物学指标。在肾脏受损后，近曲小管上皮细胞表达NGAL增多，其可以减少局部白细胞的聚集和活化，介导进入其中的中性粒细胞凋亡，减轻炎症细胞的侵害，从而促进肾小管上皮细胞的再生。

有文献[10]报道心脏介入术后发生AKI的患者在手术后1～2 h血NGAL浓度明显升高，比血肌酐明显升高要早48～72 h，血中NGAL检测特异度为74%，敏感度达90%。最近有报道显示在一项前瞻性研究中，患者均为接受选择性心脏手术的儿童，这些儿童的肾功能是正常的，但在手术后2～3 d，30%的研究对象发生了 AKI(界定血肌酐增加50%)[11]。在ICU患者发生AKI的48 h内，血浆NGAL是一个很好的预测指标，并且与 AKI的严重程度密切相关[12]。Di Grande等[13]利用蛋白组学研究发现在肾缺血和毒性动物模型中，NGAL是最早被发现和检测的蛋白质之一，血中的NGAL水平升高可在血肌酐升高前48 h出现，并与肌酐浓度呈正相关。

本研究表明血NGAL与24 h尿蛋白定量、血尿素氮、血肌酐呈正相关，对PNS合并ATN 15例患者的分析得出:100%血NGAL水平增高，但仅有约23%血肌酐升高，48%β2－MG升高，说明血NGAL升高早于传统肾功能的检测指标，对诊断早期AKI时比肌酐更有价值。

综上所述，检测血清NAGL的水平有助于肾病综合征合并急性肾损伤的早期诊断，具有无创性，较传统的肾功能指标具有更早、敏感性更高的优点，更适用于少尿性AKI，有一定的临床应用价值。

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