1株鸽新城疫病毒的分离、鉴定及生物学特性研究

仇微红 叶贺佳李 敏 孙招金 王鑫 梁昭平,2 罗开健

（1 广州市华南农大生物药品有限公司 广州 511300 2 华南农业大学兽医学院 广州 510642）

鸽Ⅰ型副黏病毒（Pigeon Paramyxovirus 1，PPMV-Ⅰ）病又称鸽瘟或鸽新城疫，是一种由禽Ⅰ型副黏病毒引起的、流行于鸽群的高度接触性急性传染病，它以肠炎、严重腹泻和神经症状为特征，是危害养鸽业的主要疫病之一[1]。笔者从广东某鸽场发病鸽中分离到了1株新城疫病毒，通过血清学试验进行了鉴定，并对该毒株进行了毒力指标测定 (ICPI、IVPI和MDT)、动物回归试验以及组织病理学观察。现将试验结果报道如下。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 试验鸡胚

10日龄SPF胚，购自北京梅里亚维通实验动物技术有限公司。

1.1.2 试验动物

30日龄雏鸽，购自江门市翔胜鸽场。

1.1.3 标准阳性血清

新城疫病毒、禽流感病毒（H5、H7、H9亚型）、EDSV76标准阳性血清，购自中国兽医药品监察所。

1.2 方法

1.2.1 病毒分离

1.2.1.1 病料采集

在广东省某大型鸽场某鸽群发生了临床症状以神经症状、腹泻为主的传染病，病死率很高，尤其以1月龄以内的雏鸽发病严重，死亡率达83%。病鸽排绿色或黄绿色的水样粪便，呈现头颈后仰（观星状）、歪头、扭颈、翅膀麻痹等神经症状。剖检病死鸽发现腺胃、肌胃出血，胰脏有白色坏死点，肝脏出血，脑充血出血，采集了病死鸽的脑、胰脏、肝脏和肺脏做病原分离与鉴定。

1.2.1.2 病料处理

取死亡鸽子的脑、胰脏、肝脏和肺脏剪碎，研磨，加入适量PBS液，反复冻融3次，离心，取上清，按终浓度分别为1000IU/mL的青霉素和链霉素，置4℃过夜，0.22μm滤器过滤，滤液用于接种鸡胚。

1.2.1.3 鸡胚接种及血凝性

病料滤过液接种10个10日龄SPF鸡胚，每胚接种0.2mL；去除24h内非特异死亡鸡胚，收集24～72h内死亡胚的尿囊液。测定尿囊液是否有血凝性，并盲传6代，每代测HA效价。

1.2.2 血凝抑制（HI）试验

以常规方法测定F2、F6代尿囊液的HA效价，并以抗ND、禽流感 (H5、H7、H9亚型)、EDSV76标准阳性血清进行血凝抑制（HI）试验。首先将收获的尿囊液配成4HAU抗原，取96孔V型微量反应板，每孔加入25μL生理盐水，第1排加25 μL标准阳性血清，每种血清做2个重复，然后将血清进行2倍系列稀释至第10孔，从第10孔吸取25μL弃去。稀释后每排第1～11孔再加入25μL4HAU抗原，反应5～10min，最后加入1%红细胞悬液25μL，用微量振荡器混匀，室温下静置30～40min。

1.2.3 病毒ELD50的测定

将分离的病毒尿囊液F6代用无菌生理盐水作10倍系列稀释，取10-6～10-105个稀释度分别经尿囊腔途径接种5枚10日龄的SPF鸡胚，0.1mL/胚，置37℃孵育96h，24h前死胚为非特异性死亡，废弃不计，记录24～96h内死亡鸡胚，按Reed-Muench法计算其ELD50。

1.2.4 毒力的测定

1.2.4.1 脑内接种致病指数（ICPI）测定

将分离的病毒尿囊液F6代以灭菌生理盐水稀释10倍，脑内注射出壳后24～36h的SPF雏鸡10只，每只0.05mL，同时设5只对照（脑内注射灭菌生理盐水0.05mL），隔离饲养，观察8d[2]。记录正常、发病与死亡鸡的每日累计数，正常鸡积分为0、发病为1、死亡为2，最后计算ICPI，ICPI=（8d累计发病数×1+8d累计死亡数×2）/8d累计鸡只总数。

1.2.4.2 静脉接种致病指数（IVPI）测定

将分离毒种F6代以灭菌生理盐水稀释10倍，翅静脉接种42d SPF鸡10只，每只0.1mL，同时设5只对照（静脉注射灭菌生理盐水0.1mL），隔离饲养，观察10d。记录正常、发病、麻痹与死亡鸡的每日累计数，正常鸡积分为0、发病为1、麻痹为2、死亡为3，最后计算 IVPI[2]，IVPI=（10d累计发病数×1+10d累计麻痹数×2+10d累计死亡数×3）/10d累计鸡只总数。

1.2.4.3 MDT测定

将分离的病毒尿囊液F6代以灭菌生理盐水分别稀释成10-5～10-9，每个稀释度分别接种9日龄SPF鸡胚10枚，每胚0.1mL，37℃继续孵化，弃去24h内的死胚，以后每天照蛋3次，记录胚胎残废时间，取尿囊液测定HA效价，持续7d，取全部致死鸡胚的最大稀释度死胚的记录，计算MDT[2]，MDT=（Xh×Xh死亡胚数+Yh×Yh死亡胚数）/死亡胚总数。

1.2.5 动物回归试验及病理切片观察

F6代病毒尿囊液经10-2稀释，通过滴鼻和肌肉注射的方式对30日龄左右的10只雏鸽进行攻毒，肌肉注射0.5mL/只。另设5只健康鸽作为空白对照。攻毒后观察每组鸽的发病和死亡情况，观察2周，并对发病及死亡鸽做组织病理学观察。

2 结果

2.1 病毒分离、鉴定结果

2.1.1 各代次鸡胚尿囊液HA效价

病料滤过液接种的10枚SPF胚中，有6枚于24～72h内死亡，胚体充血、出血，逐胚测定各代次鸡胚尿囊液HA效价，F1～F6各代尿囊液平均HA效价分别为 23.6、25.3、26.5、27.2、28.3、210.0。

2.1.2 血凝抑制（HI）试验结果

鸡胚尿囊液血凝性仅被NDV的标准阳性血清所抑制，而不被禽流感（H5、H7、H9亚型）及EDS76标准阳性血清所抑制。

2.2 F6代病毒尿囊液病毒含量的测定结果

经测定，该分离株的ELD50为10-8.60/0.1mL。

2.3 毒力的测定结果

经测定，该分离株的ICPI为1.64，IVPI为2.2，MDT为 44.1h。

2.4 动物回归实验结果

攻毒后4d，所有试验鸽精神沉郁，出现神经症状，表现头颈后仰（观星状）、歪头、扭颈及翅膀麻痹等，肛门周围粘满绿色粪便。剖检可见肌胃、腺胃出血，肠黏膜出血，里面充满黄色黏液，脑部也见轻微出血。组织病理学观察脑部脑膜充血瘀血，血管周围间隙增宽，淋巴细胞浸润；脾脏瘀血，大量浆细胞聚焦；肝脏瘀血；肠道固有层大量浆细胞浸润；气管分泌旺盛，固有层瘀血，炎症细胞浸润（图1～5）。

3 小结与讨论

3.1 根据从发病鸽中分离到病毒具有血凝性，且能被抗NDV血清所抑制，而不被禽流感（H5、H7、H9亚型）及EDSV76标准阳性血清所抑制，以及动物回归试验结果及组织病理学检查结果可以判定鸽群感染了新城疫病毒，病毒和以往报道[3-5]的关于鸽新城疫病毒的特性相一致。

图1 脑部病理组织变化

图3 肝脏病理组织变化

图4 肠道病理组织变化

图5 气管病理组织变化

3.2 目前用于评价新城疫病毒毒力强弱的指标主要有 MDT、ICPI、IVPI，强毒的 MDT小于 60h，ICPI在1.5～2.0之间，IVPI在2.0～3.0之间。本研究中分离株的 ICPI为 1.64、IVPI为 2.2、MDT为 44.1h，符合强毒的标准。

3.3 鸽新城疫病毒感染为危害养鸽业的最主要的疾病之一，但对本病迄今尚无特异性的有效治疗药物，关键在于预防。尽管鸽新城疫病毒与鸡的新城疫病毒为同一属，但许多报道表明用现有的鸡新城疫疫苗免疫鸽群后保护效果并不理想[6]。因此，分离、培育出免疫原性良好的毒株，研制出具有良好免疫效力的鸽用新城疫疫苗对预防本病至关重要。本研究中分离株的基因分型以及其免疫原性等有待进一步的研究。

[1]Kaleta E F，Alexander D J，Russell P H.The first isolation of the PPMV-I virus responsible for the current panzootic in pigeons [J].Avian poulty，1985，14：553-557.

[2]国际兽医局(OIE)推荐的《动物疫病诊断方法和生物制品要求手册》[M].1992,31-37.

[3]何叶峰，秦卓明，贾强.鸽I型副黏病毒的分离和鉴定[J].中国兽医杂志，2002，38（11）.

[4]邹永新，刘思伽.鸽I型副黏病毒病的病原特性[J].Poultry Science，2005，10：47-49.

[5]贺东生，姜峥嵘，陈学杰，等.鸽I型副黏病毒的分离和鉴定[J].中国动物防疫，2001，18（9）：26-28.

[6]张淑霞，杨增歧，赵余放，等.鸽新城疫油乳佐剂灭活苗对鸽免疫效果观察 [J]. 中国预防兽医学报，1999，21(3)：163-165.