乌司他丁对心肺复苏后兔脑组织氧化应激损伤的影响*

夏金明，胡春林，李 欣，李 慧，魏红艳，李颖庆，廖晓星，荆小莉△

(1中山大学附属第一医院急诊科，广东 广州 510080;2杭州师范大学附属医院急诊科，浙江 杭州 310015)

随着人口老龄化，心脑血管病已经成为当今社会最主要、最常见的疾病之一，心脏性猝死(sudden cardiac death，SCD)也随之成为中老年患者死亡的重要原因，而有效的心肺复苏(cardiopulmonary resus-citation，CPR)是成功抢救这类患者的首要步骤。尽管由于CPR新指南的出台、复苏技术的发展和公众CPR技术的普及，SCD病人的自主循环恢复(return of spontaneous circulation，ROSC)率得到了显著提高，成功率可达20%～50%［1］，然而仅有2%～15%的病人能存活出院［2］，大多数病人死于CPR后全脑缺血缺氧导致的神经元损伤，即使幸免存活者，其中40%～50%也伴有不同程度的神经功能障碍和缺失［3］。因此，脑复苏是CPR成功的关键。

氧化应激损伤是CPR后脑损伤的主要机制之一［4］，而核因子 E2相关因子2(nuclear factor E2－related factor 2，Nrf2)是机体对抗氧化应激最重要的细胞防御机制［5］。Nrf2通过与胞浆蛋白 Kelch样环氧氯丙烷相关蛋白－1(Kelch－like epichlorohydrinassociated protein 1，KEAP1)以及抗氧化反应元件(antioxidant response element，ARE)相互作用，启动下游编码抗氧化蛋白和 II相解毒酶的基因表达，发挥细胞保护作用［6］。我们前期的研究表明乌司他丁(ulinastatin，UTI)可减轻 CPR 后脑损伤［7］，但其具体机制还不清楚。本文从UTI对CPR后氧化应激的影响探讨UTI的脑保护作用机制，类似研究国内外还未见报道。

材料和方法

1 动物与分组

56只雄性新西兰成年大白兔，由中山大学实验动物中心提供。动物购进后饲养1周，实验前晚禁食不禁水。实验1:8只新西兰兔建立CA模型，ROSC后24 h内连续采血监测血浆丙二醛(malondialdehyde，MDA)和还原型谷胱甘肽 (glutathione，GSH)水平。实验2:48只新西兰兔建立CA模型，ROSC后随机分为模型组(model组)和UTI组，每组分别于ROSC后2 h、4 h和8 h取大脑皮层和海马，测定MDA和GSH含量，检测Nrf2激活情况;其余动物存活72 h后取大脑皮层和海马，TUNEL法检测原位细胞凋亡。

2 主要试剂及设备

MDA和GSH测定试剂盒购自南京建程生物工程研究所;TUNEL凋亡试剂盒购自Roche;BCA法蛋白定量试剂盒、核/胞浆蛋白提取试剂盒购自北京百泰克生物技术有限公司;戊巴比妥钠购自Sigma;Nrf2试剂盒购自Abcam;UTI购自广州天普生化医药股份有限公司。小动物呼吸机(RODENT VENTILATOR 683.Harvard Apparatus);4道生理信号采集分析系统(BIOPAC SYSTEMS MAP150，Inc.MP100A －CE Santa Barbara);动物除颤仪(SAN－ei Cardiopace 3MII)。

3 方法

3.1 术前准备 戊巴比妥钠(30 mg/kg)经兔左耳缘静脉注入，麻醉成功后，胸部备皮。选择3.0号气管导管经口气管插管，常规Ⅱ导联心电监护，小号留置针穿刺右耳动脉，接高敏感换能器监测动脉血压。心电图和动脉血压通过4道生理信号采集分析系统连续记录在电脑上。

3.2 建立CPR模型 按照本课题组前期的研究方法建立室颤－CPR模型［8－10］。采用经胸体表交流电(6 V，50 Hz)诱发室颤，诱发时间5～10 s。成功诱发室颤的标准为:心电监护显示室颤波形，血压迅速下降，接近0 mmHg。室颤持续5 min后开始CPR，行心前区胸外心脏按压，频率为200次/min，深度为胸腔前后径的1/3;同时接呼吸机，通气频率为45次/min，潮气量约10 mL/kg(根据血气分析结果调整呼吸机参数，使PCO2控制在35～45 mmHg之间)。复苏期间每3 min给予肾上腺素20 μg/kg。按压2 min后给予电除颤，选择能量为20～30 J。如15 min未恢复自主循环，终止实验。判断ROSC成功的标准为:恢复自主心律，平均动脉压大于60 mmHg并持续30 min以上。UTI组动物ROSC后立即给予UTI 10×104U/kg一次性经左耳缘静脉注入，而model组只给予等体积的生理盐水注入。ROSC后维持实验动物平均动脉血压大于60 mmHg，补充生理需要的能量。ROSC后所有动物维持机械通气2～3 h，断开呼吸机后如呼吸节律规则且血流动力学稳定，并持续1 h以上，停机械通气。ROSC后不予以维持麻醉。所有实验数据按照UTSTEIN模式记录。

3.3 血浆MDA和GSH水平测定 实验1组动物分别于复苏前、ROSC 后 0.5 h、1 h、1.5 h、2 h、2.5 h、3 h、3.5 h、4 h、5 h、7 h、9 h、12 h、18 h 和 24 h 从左耳缘静脉采血，离心后取上清用硫代巴比妥酸(thibabituric acid，TAB)法测定血浆MDA，用二硫代二硝基苯甲酸［5，5’－dithiobis(2－nitrobenzoic acid)，DTNB］法测定GSH。

3.4 脑组织MDA和GSH含量测定 ROSC后2 h、4 h和8 h 3个时点各取4只兔并取其大脑皮层和海马，组织匀浆后用BCA法测定匀浆蛋白浓度，并测定MDA和GSH含量，计算出每毫克组织中MDA和GSH的含量。

3.5 Western blotting检测Nrf2蛋白水平 处理不同时段脑组织冻存标本，按照核/胞浆蛋白提取试剂盒说明，提取胞浆蛋白和核蛋白，BCA法蛋白定量。取50 μg蛋白进行聚丙烯酰胺凝胶电泳，按湿转法将电泳产物转移到PVDF膜，5%的脱脂奶粉封闭2 h，滴加Ⅰ抗(1∶1000)4℃过夜，TBST洗膜，5 min×3次，滴加HRB标记的Ⅱ抗(1∶3000)室温下孵育1 h，TBST洗膜，5 min×3次，Milipore发光液浸泡1 min，Koda胶片曝光，显影、定影，计算蛋白灰度。

3.6 脑组织凋亡神经元计数 ROSC后72 h过量麻醉处死动物，取大脑皮层和海马组织，用4%甲醛固定，做石蜡切片后TUNEL法原位细胞凋亡检测，在光镜400倍视野下，计数100×100像素内凋亡细胞数。

4 统计学处理

将数据录入SPSS 13.0统计软件，依据正态检验(Kolmogorov－Smirnov)结果数据分别用均数±标准差()或中位数(第1四分位数，第3四分位数)表示，用t检验或秩和检验(Mann－Whitney rank)，以P＜0.05为差异有统计学意义。

结 果

1 致颤及ROSC情况

实验1中8只动物，均致颤成功，有6只存活至ROSC后24 h。实验2中48只动物，均致颤成功，ROSC后2、4和8 h，每组各时点均分别处死4只动物，取材。Model组和UTI组各有6只存活到ROSC后72 h。2组动物的生理学参数如体重(body weight，BW)、心率(heart rate，HR)、呼吸频率(respiratory rate，RR)、平均动脉压(mean arterial pressure，MAP)和复苏相关的指标如基础生命支持时间(basic life support，BLS)、除颤次数(defibrillation times，DF－T)、肾上腺素(adrenaline，AD)用量之间没有显著差异，见表1、2。

表1 2组动物CPR前一般生理参数Table 1.Physiological parameters in the two groups before CPR(.n=18)

表1 2组动物CPR前一般生理参数Table 1.Physiological parameters in the two groups before CPR(.n=18)

Group BW(kg) HR(min－1) RR(min－1) MAP(mmHg)Model 2.39±0.33 251.37±51.37 43.32±4.68 83.83±17.98 UTI 2.43±0.19 270.73±28.31 42.45±5.39 84.63±10.11

表2 2组动物CPR相关指标Table 2.CPR－related indicators in the two groups(.n=18)

表2 2组动物CPR相关指标Table 2.CPR－related indicators in the two groups(.n=18)

Group BLS(min) DF－T AD(μg)Model 2.16 ±1.81 1(0，2)126.53 ±63.04 UTI 2.56 ±1.25 1(0，2)132.91 ±59.52

2 ROSC后24 h内血浆MDA和GSH的变化

ROSC后血浆MDA迅速升高，在ROSC后1.5～2 h左右达到峰值水平(195.51±23.57)μmol/L，见图1A，ROSC后血浆GSH明显下降，在ROSC后2 h达到最低谷［(69.89±14.53)mmol/L］，见图1B。

Figure 1.The changes of plasma MDA(A)and GSH(B)levels in 24 h after ROSC..n=6.图1 ROSC后24 h内血浆MDA和GSH的变化

3 ROSC后2 h、4 h和8 h脑组织MDA和GSH的含量

ROSC后2 h、4 h和8 h 3个时点2组动物大脑皮层与海马MDA含量见表3，结果发现UTI组ROSC后脑组织MDA含量明显低于model组，2组差异有统计学意义。

表3 ROSC后2 h、4 h和8 h兔脑组织MDA含量Table 3.The concentration of MDA in rabbit brain tissues at 2 h，4 h and 8 h after ROSC［μmol/(g protein)..n=4］

表3 ROSC后2 h、4 h和8 h兔脑组织MDA含量Table 3.The concentration of MDA in rabbit brain tissues at 2 h，4 h and 8 h after ROSC［μmol/(g protein)..n=4］

*P ＜0.05，＊＊ P ＜0.01 vs model group.

Hippocampus 2 h 4 h 8 h 2 h 4 h 8 h Model 17.28 ±1.43 14.75 ±1.20 12.12 ±1.24 17.1 Group Cortex 9 ±1.35 13.42 ±4.27 12.21 ±1.83 UTI 13.05 ±1.25＊＊ 11.51 ±0.68＊＊ 8.71 ±0.92＊＊ 13.02 ±1.19＊＊ 10.95 ±1.00* 7.59 ±1.92＊＊

ROSC后2 h、4 h和8 h 3个时点2组动物大脑皮层与海马GSH含量见表4，UTI组ROSC后脑组织GSH含量明显高于model组，2组间差异有统计学意义。

表4 ROSC后2 h、4 h和8 h兔脑组织GSH含量Table 4.The concentration of GSH in rabbit brain tissues at 2 h，4 h and 8 h after ROSC［mmol/(g protein)..n=4］

表4 ROSC后2 h、4 h和8 h兔脑组织GSH含量Table 4.The concentration of GSH in rabbit brain tissues at 2 h，4 h and 8 h after ROSC［mmol/(g protein)..n=4］

＊＊ P ＜0.01 vs model group.

Hippocampus 2 h 4 h 8 h 2 h 4 h 8 h Model 1.97 ±0.58 1.59 ±0.36 1.22 ±0.24 2.22 ±0.Group Cortex 74 1.76 ±0.72 1.02 ±0.34 UTI 4.36 ±1.00＊＊ 3.61 ±0.86＊＊ 3.05 ±0.90＊＊ 4.59 ±0.53＊＊ 3.88 ±0.36＊＊ 3.13 ±0.32＊＊

4 Western blotting检测Nrf2蛋白水平

Western blotting检测结果显示，ROSC后2、4和8 h model组胞核/胞浆Nrf2蛋白表达分别为0.91±0.08、0.87±0.04和 0.79±0.09，明显低于同时段UTI组(1.07±0.06、1.04±0.09和0.98±0.07，均P ＜0.05)，见图2。

Figure 2.The expression of Nrf2 in the cortex of rabbits after ROSC..n=4.*P＜0.05 vs model group.图2 ROSC后兔大脑皮层Nrf2蛋白的表达

5 ROSC后72 h大脑皮层及海马内神经元凋亡情况

ROSC后72 h 2组大脑皮层凋亡神经元数目model组为8.8±1.5，UTI组为5.7±1.0，P ＜0.01。海马CA1～CA3区model组凋亡神经元数目分别为17.2±1.2、13.5 ±2.1和17.3±2.7，明显多于 UTI组(14.2±1.5、11.0±0.9和13.7±1.6，P＜0.05或P ＜0.01)，见图3。

Figure 3.The apoptosis of neurons in cortex and hippocampus CA1～CA3 areas after ROSC 72 h(TUNEL staining，×400)..n=6.*P ＜0.05，＊＊P ＜0.01 vs model group.图3 ROSC后72 h大脑皮层和海马CA1～CA3区神经元凋亡情况

讨 论

CA后机体血液循环近乎停止，全身各脏器和组织处于极为严重的缺血缺氧状态，经过有效及时的心肺复苏，ROSC后全身血运得以重建，但机体又将会面临新的伤害，即再灌注损伤［11］。大脑血液循环丰富，耗氧量也是全身最多的器官，因此CA会对脑组织产生极为严重的影响和后果，而神经元损伤会选择性出现在一些对缺血再灌注极为敏感的脑区，如海马、丘脑网状核和大脑皮层［3］等部位，而氧化应激损伤则是CPR后继发性脑损伤的主要机制之一［4］。

氧自由基会引起生物体内尤其是脑组织蛋白质、核酸和脂质过氧化损伤［12］，导致体内氧化与抗氧化作用平衡失调，产生MDA等大量过氧化降解产物，破坏细胞膜，引起线粒体和内质网结构和功能改变，加重细胞能量代谢障碍，反过来促进新自由基的产生，周而复始，最终导致了神经元凋亡和坏死［13］。氧自由基还可使细胞色素C、凋亡蛋白酶激活因子1(apoptotic protease－activating factor 1，Apaf－1)等释放增加，通过多条途径导致神经元凋亡［3］。

在实验1中我们发现新西兰兔历经5 min的室颤以及随后2～5 min的CPR，自主循环恢复后血浆中MDA明显增高，在ROSC后2 h达到峰值水平，而体内重要的抗氧化剂GSH在CPR后有所下降，在ROSC后2 h达到最低谷。上述结果表明CA后机体出现了明显的氧化应激损伤，氧化产物大量产生，抗氧化物质明显减少，两者之间动态平衡被完全打破。因此，尽早干预ROSC后的失控性氧化应激损伤可能会给CA病人带来益处。

UTI是一种强力的蛋白酶抑制剂，可抑制多种酶的活性，能通过多种途径阻滞炎症反应及氧化应激的中间环节，减少TNF－α等致炎因子及介质的释放［14］，抑制氧自由基的生成，降低血脑屏障通透性，减轻脑水肿，从而保护脑细胞［15－16］。我们在实验2中观察UTI对ROSC后不同时点大脑皮层、海马内MDA、GSH含量的变化和对神经元凋亡的影响，结果表明UTI明显减少ROSC后实验动物大脑皮层及海马内MDA含量、提高GSH含量。因此，我们认为UTI可显著抑制兔ROSC后大脑皮层和海马MDA水平，提高GSH含量，加强机体内抗氧化能力，维持氧化与抗氧化之间的平衡，保护大脑皮层及海马神经元。

Nrf2是细胞内抗氧化应激的重要转录因子。在生理状态下，Nrf2与KEAP1以二聚体的形式存在于细胞浆中［6］。在基础条件下，绝大部分Nrf2以非活性状态储存于细胞质中，与 KEAP1相偶联，后者与胞浆肌动蛋白结合而被锚定在胞浆，通过泛素介导的蛋白降解系统维持Nrf2的基础水平;另一部分Nrf2以活性状态存在于细胞核中介导基因的基本转录。泛素化的Nrf2很快被26S蛋白酶体降解，使Nrf2通路关闭，抑制26S蛋白酶可能使Nrf2在细胞核堆积，持续开放Nrf2通路［17］。26S蛋白酶是泛素化酶系统的重要成员，缺血再灌注后26S蛋白酶被激活，广泛参与组织损伤，抑制其激活可减轻组织损伤，保护缺血性心肌损伤［18－20］，UTI可能通过抑制26S蛋白酶，减少Nrf2降解，促进其转入细胞核内。在实验2中Western blotting结果显示Nrf2蛋白表达在ROSC后2 h、4 h和8 h UTI组 Nrf2的胞核/胞浆比明显高于model组，表明CPR后UTI可促进Nrf2转入细胞核内与ARE相互作用，启动下游的抗氧化蛋白、II相解毒酶、蛋白酶体和分子伴侣等基因转录和表达［21］，发挥其抗氧化作用，保护全身组织器官免受缺血再灌注带来的氧化损伤，减少神经元凋亡。

UTI已被广泛应用于临床，但在CPR后用于预防继发性脑损伤的研究还比较少，我们的研究表明UTI可升高ROSC后兔脑组织GSH水平，降低MDA含量，增加Nrf2的表达，减少神经元的凋亡，为UTI用于预防CPR后继发性脑损伤的治疗提供了一定的理论基础，其有效性还有待临床研究来证实。

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