慢性排斥肾移植大鼠继发对自身组织蛋白vimentin的细胞和体液免疫反应①

方 成 李 琦 刘 立 陈 薇 胡汉宁 梁慧芳 王加谋 瞿永华 谢德芳

(武汉工业学院医学院移植免疫实验室，武汉430023)

慢性排斥导致免疫损害是异体移植物失功的主要原因［1］。主要组织相容性抗原(MHC)是异体移植排斥反应的主要靶抗原，但是在慢性移植排斥的病人中，还可能存在针对自身抗原的免疫反应。本研究关注移植后新发的自身免疫反应，而非复发的自身免疫疾病。临床资料显示肾移植后病人可产生针对集聚蛋白(agrin)、热休克蛋白60(Hsp60)等抗原的多种自身免疫抗体［2-4］。而vimentin特异性自身反应CD8+T细胞在心脏移植病人体内发现［5］。因此对移植后并发自身免疫反应的研究，有助于全面理解慢性免疫损害导致的移植物失功能。

vimentin是一种细胞中间丝骨架蛋白，广泛存在于内皮细胞、成纤维细胞［5］。本试验在观察大鼠慢性移植肾肾病(CAN)进程的基础上，检测自身抗原vimentin特异性细胞免疫(IFN-γ分泌T细胞)和体液免疫(特异性抗体)的发生及强度变化，确定vimentin是否肾移植后自身免疫靶抗原，探讨肾移植后自身免疫反应的特征。

1 材料与方法

1.1 动物及试剂 雄性近交系F344(RT11v1)和Lewis(RT11)大鼠，12～15周龄，体质量220～250 g，由北京维通利华实验动物技术公司提供(许可证号SCXK京2006-0009)，20℃ ～24℃/12小时光照条件下标准鼠粮饲养。重组大鼠vimentin蛋白购自英国Cytoskeleton公司，大鼠IFN-γ酶联免疫斑点检测(ELISPOT)试剂盒购自荷兰U-Cytec公司，PVDF膜96孔板为Millipore美国公司产品，辣根过氧化物酶标记(HRP)山羊抗大鼠IgG购自美国Santa Cruze公司，TMB显色剂购自碧云天公司，刀豆素A购自达科为公司。

1.2 大鼠肾移植模型及分组 Lewis大鼠左肾被F344大鼠供肾取代，7天后行右侧肾切除术，受体不使用免疫治疗可长期存活，建立经典慢性排斥肾移植模型［6］。慢性排斥组(n=12)在术后第 14、49、98天处死4只收获肾脏、脾脏及血清行病理及免疫检测，未干预Lewis大鼠作为正常对照(n=3)。Lewis大鼠自体肾移植作为移植耐受组(n=3)，在术后第98天获肾脏、脾脏、血清作检测。

1.3 肾功能检测 术后14天始收集尿液进行肾功能检测，每2周检测1次。受体代谢笼内禁食可随意饮水，收集24小时。尿总蛋白浓度(g/L)以考马斯亮蓝法，尿肌酐浓度(mmol/L)以苦味酸法，使用美国Abbott公司Aeroset全自动生化分析仪测定。蛋白尿指标依照以下公式计算［7］:蛋白尿(g/mmol)=尿蛋白(g/L)/尿肌酐(mmol/L)。

1.4 组织病理检查 慢性移植肾肾病(CAN)的评定参照05年修订 Banff 97标准［8，9］。大鼠肾脏以4%甲醛固定，石蜡切片进行HE、PAS和Masson染色，以肾间质和肾小管纤维化程度为评级指标，肾小球和血管硬化情况作为辅助观测。肾小管、肾间质的慢性损害程度以0～3分评定，无纤维化改变为0分，受累面积≤25%、≤50%、＞50%分别为1、2、3分。每个标本100倍镜下双盲观测5个视野，取平均值。

1.5 酶联免疫斑点试验(ELISPOT) 无菌收获受体脾脏，将脾脏研磨通过200目不锈钢滤网。裂解红细胞后，有核细胞以PBS清洗两次，细胞重悬于RPMI1640培养基。PVDF膜96孔板以5μg/ml抗大鼠IFN-γ捕获抗体4℃包埋过夜。清洗该板后以含3%牛血清白蛋白的PBS液37℃封闭1小时。为检测IFN-γ分泌性T细胞反应，每孔3×105个脾细胞在完全RPMI1640培养基中孵育36小时，使用vimentin抗原(10μg/ml)刺激。以加入等体积PBS作为阴性对照，加入刀豆素A作为阳性对照。中止孵育洗板后，加入2μg/ml生物素标记的抗大鼠IFN-γ检测抗体，37℃孵育2小时。再以10%小牛血清PBS稀释的辣根过氧化物酶标记的亲和素，37℃孵育1小时。洗板后，加入底物AEC显色15分钟。显色斑点用美国CTL公司Immuno Spot分析仪分析。

1.6 酶联免疫吸附试验(ELISA) 为检测大鼠血清中的抗vimentin抗体，先以vimentin蛋白(10μg/ml)4℃包埋ELISA板过夜，仅加入PBS作为对照孔。洗板并以3%牛血清白蛋白封闭后，加入稀释大鼠血清样本(1/25)37℃孵育2小时。洗板后加入HRP标记山羊抗大鼠IgG抗体检测，最终加入底物TMB显色20分钟，用美国Bio-Rad公司iMARK酶标仪读取415 nm吸光度。

1.7 统计学分析 统计分析使用Prism(4.00)软件。数值用±s表示。多组间数据比较使用单因素方差分析，辅以指定两组间秩和检验。所有统计分析使用双侧比较，P＜0.05则差异具有显著性。

2 结果

2.1 慢性排斥移植肾功能逐渐衰竭 正常大鼠及自体肾移植组的蛋白尿水平稳定在(0.03～0.05)g/mmol。慢性排斥肾移植组蛋白尿水平在2～6周略有升高，维持于(0.15 ～0.20)g/mmol。术后8 周蛋白尿水平明显上升，达到(0.42±0.17)g/mmol。第10 周和第12 周时分别为(0.81 ±0.37)g/mmol、(0.87 ± 0.36)g/mmol，肾功能已出现显著损害(P ＜0.05，图1)。

2.2 慢性排斥移植肾逐渐发生CAN 自体移植肾在98天时无肾病病理改变。F344-Lewis移植肾在49天出现肾间质纤维化(1.2±0.2)、肾小管萎缩(1.5±0.3)、肾小球硬化，呈现典型的 CAN 病理改变。至第98天时移植肾体积已明显萎缩，外表粗糙，镜下可发现广泛的肾间质纤维化(2.2±0.2)、肾小管萎缩(2.5±0.3)及肾血管内膜增厚(见图2)。

2.3 同种肾移植受体出现vimentin反应性T细胞

图1 同种肾移植大鼠受体蛋白尿动态检测Fig.1 The proteinuria levels of rat recipients with renal allograft

图2 同种大鼠移植肾组织学改变(HE×200)Fig.2 Light microscopic examination of renal allograft(HE×200)

收获受体脾脏细胞体外培养，以vimentin为刺激物检测特异性IFN-γ分泌T细胞的数量。术后14天慢性排斥组vimentin反应性T细胞数量增加，在肾移植后49天其数量明显增多(28.3±2.0 vs.10.1±2.1)，98 天时其数量急剧上升，与对照孔有非常显著性差异(126.0 ±10.4 vs.26.3 ±4.1，P ＜0.01，见图3)。在自体肾移植组，术后98天未发现vimentin特异性IFN-γ分泌T细胞。

2.4 同种肾移植受体vimentin抗体水平升高 在肾移植慢性排斥组，肾移植后14、49和98天收获受体血清，体外检测vimentin反应性抗体水平(见图4)，术后14天时vimentin抗体水平比正常鼠显著升高(0.230 ±0.018 vs.0.063 ±0.008，P ＜0.05)，术后49天及98 天持续上升(0.257 ±0.031，0.350 ±0.017)。而自体肾移植大鼠术后98天检测vimentin抗体水平无明显改变。

图3 肾移植大鼠vimentin反应性IFN-γ分泌T细胞数量Fig.3 The frequencies of vimentin-specific IFN-γ secreting T cells from rat recipients

图4 同种肾移植大鼠受体vimentin特异性IgG抗体水平变化Fig.4 The production of vimentin-specific IgG antibodies in rat recipients with renal allograft at different time points

3 讨论

慢性移植物失功能是各种移植器官后期丢失的主要原因。移植肾肾病、移植肺支气管肺炎、移植肝肝硬化等导致各种移植器官的功能衰竭，最终使受体再次面临生命威胁［10-12］。慢性移植肾肾病的临床表现为进行性肾功能减退、蛋白尿和高血压，最终肾功能衰竭。其组织学表现为肾间质纤维化、肾小管萎缩、肾小球硬化和小动脉内膜炎等病理改变。有数据显示慢性移植肾肾病术后6个月发生率达34.8%，术后 5 年发生率高达 60%［13，14］。急性排斥反应、慢性排斥反应、原有肾病复发、缺血再灌注损伤等作为慢性移植肾肾病的高风险因素受到关注［10-14］。

但肾移植后继发自身免疫反应的现象却不容忽视，这种自身免疫限定为移植后新发的自身免疫反应，而非复发的自身免疫疾病。临床资料显示在伴有CAN的长期存活受体内可产生针对多种自身抗原的抗体，类似的情况在临床肺脏、肝脏、胰腺移植中均存在［2-4，15-17］。已发现的人体肾移植后自身反应性组织蛋白有agrin、Hsp60等，例如在44%(6/17)的移植后肾小球肾炎病人体内发现针对肾小球基底膜上肝素硫酸化蛋白多糖Agrin的抗体［3］。作者也曾在同种肾移植大鼠体内检测到自身组织蛋白megalin(脂蛋白受体家族成员)抗体的持续存在［18］。对移植后继发的自身免疫及相关抗原的研究，是全面理解慢性移植物损害不可或缺的部分。

在本实验大鼠同种肾移植慢性排斥模型中，术后49天时出现明显蛋白尿及肾纤维化，发生典型CAN病变，并逐渐加重。观察针对自体抗原的特异性细胞和体液免疫反应，是评价移植后自身免疫的有效方法。vimentin是一种中间丝骨架蛋白，广泛表达于内皮细胞、成纤维细胞，在肾小管、肾血管内皮及间质细胞有丰富表达，是一种保守的自身组织抗原［5］。本实验中自身组织蛋白vimentin特异性IgG抗体在移植后14天即出现，抗体水平较正常大鼠有显著性差异，其后抗体水平逐渐升高;而vimentin特异性IFN-γ分泌性T细胞数量在49天出现明显升高，98天时数量急剧上升。大鼠同种肾移植慢性排斥模型发生了自身免疫反应并逐渐增强，vimentin是肾移植后继发自身免疫反应的靶抗原。

同种移植组在98天时抗vimentin细胞及体液免疫均呈现显著反应，而在自体肾移植组术后98天未检测到抗vimentin抗体及细胞，可以判断异体排斥损害是发生移植后自身免疫反应的诱导因素。有实验研究肺部注射MHCⅠ类抗原的抗体，即可诱发肺脏自身组织抗原的免疫反应［19］。

抗vimentin抗体在术后14天即显著升高，而vimentin特异性IFN-γ分泌性T细胞数量在早期未见显著升高，提示早期vimentin抗体的产生并非初次应答。可以设想在异体排斥导致的固有免疫活化及vimentin抗原决定簇持续暴露条件下，禁忌的自身反应B细胞重新活化，在移植早期即产生高水平IgG抗体。记忆性B细胞产生抗体及递呈抗原的能力，在自身抗原反应强化过程中或许发挥着重要的诱导作用。

有实验研究从移植肺浸润细胞中分离出胶原蛋白Ⅴ(CollagenⅤ)的自身免疫T细胞 ，能表达IL-17和IL-23辅助免疫反应［20］。移植前诱导的 vimentin自身免疫可以加重移植心脏慢性损害［21］。本实验中vimentin特异性IFN-γ分泌T细胞数量在肾移植49天后急剧增加，显示肾移植后自身免疫细胞反应可能在后期发挥更强烈的作用。vimentin自身反应性T细胞的大量出现，及高水平vimentin自身抗体的持续存在，表明自身免疫反应在肾移植受体可以被全面激活，而vimentin是肾移植后自身免疫的有效抗原。对移植后继发自身免疫导致移植肾损害程度进行独立评估，是有待进一步研究的课题。

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