HPLC法测定大黄提取物中芦荟大黄素、大黄酚、大黄素甲醚的含量

闫海燕

(宝鸡文理学院 陕西省植物化学重点实验室，陕西 宝鸡 721013)

大黄(RheumpalmatumL.)为蓼科植物掌叶大黄、唐古特大黄和药用大黄的干燥根及根茎，是一种多年生草本植物，其主要药用成分为蒽醌类衍生物[1]。作者建立了同时测定大黄提取物中芦荟大黄素、大黄酚、大黄素甲醚的高效液相色谱法，拟为该药材的质量控制提供依据。

1 实验

1.1 材料、试剂与仪器

马蹄大黄，宝鸡方晟药业公司。

芦荟大黄素、大黄酚、大黄素甲醚对照品，纯度>98%，天津马克生物技术有限公司；甲醇为色谱纯；实验用水为娃哈哈纯净水。

Agilent 1200型高效液相色谱仪，美国；CP225D型电子分析天平，德国Sartorius；KQ-300VDE型双频数控超声波清洗器。

1.2 色谱条件

色谱柱：Prontosil-C18-ace-Eps(250 mm×4.6 mm，5 μm)，流动相为甲醇-水(90∶10，体积比)，流速1.0 mL·min-1，检测波长254 nm，柱温25 ℃，进样量20 μL。

1.3 对照品溶液的配制

精密称取适量芦荟大黄素、大黄酚、大黄素甲醚对照品，加甲醇定容至刻度，分别配制成32.6 μg·mL-1、65.0 μg·mL-1、49.6 μg·mL-1的对照品溶液，备用。

1.4 供试品溶液的制备

称取0.5 g生药大黄粉末，精密称定，加入甲醇25 mL，加热回流30 min，放冷，滤过，取滤液5 mL蒸干，残渣加8%盐酸溶液10 mL，超声提取2 min，再加氯仿10 mL，加热回流1.5 h，放冷，置分液漏斗中，用少量氯仿洗涤容器也置于分液漏斗中，分取氯仿层，酸液再用氯仿提取3次，每次10 mL，合并氯仿液，减压回收氯仿，残渣用甲醇溶解并转移到10 mL容量瓶中定容。摇匀，滤过，取滤液作为供试品溶液。

1.5 线性关系考察

精密移取芦荟大黄素、大黄酚、大黄素甲醚混合对照品溶液，按1.2色谱条件进样测定。以峰面积(y)为纵坐标、对照品浓度(x)为横坐标绘制标准曲线，并进行线性回归。

1.6 精密度实验

精密吸取同一浓度混合对照品溶液，在相同色谱条件下连续进样6次，每次20 μL，分别测定峰面积。

1.7 稳定性实验

取同一供试品溶液，按1.2色谱条件分别于室温下第0 h、4 h、8 h、12 h、24 h进样测定。

1.8 重现性实验

分别精密称取大黄粗粉6份并制成供试品溶液，按1.2色谱条件进样测定。

1.9 加标回收率实验

精密称取已知含量大黄粗粉0.5 g，分别加入芦荟大黄素、大黄酚、大黄素甲醚对照品适量，制成供试品溶液，按1.2色谱条件进样测定。

1.10 样品含量测定

精密称取大黄粗粉0.5 g，制成供试品溶液，按1.2色谱条件进样测定。

2 结果与讨论

2.1 对照品与供试品的HPLC图谱(图1)

1.芦荟大黄素 2.大黄酚 3.大黄素甲醚

2.2 线性回归方程及线性范围(表1)

表1 线性回归方程及线性范围

2.3 精密度

精密度实验中，芦荟大黄素、大黄酚、大黄素甲醚峰面积的RSD分别为0.60%、0.76%、0.27%(n=6)。表明仪器精密度良好。

2.4 稳定性

稳定性实验中，芦荟大黄素、大黄酚、大黄素甲醚的RSD分别为0.94%、1.36%、1.23%(n=5)。表明供试品溶液在24 h内稳定。

2.5 重现性

重现性实验中，芦荟大黄素、大黄酚、大黄素甲醚的RSD分别为1.36%、0.96%、1.96%(n=6)。表明该方法重现性良好。

2.6 加标回收率

测定结果表明，芦荟大黄素、大黄酚、大黄素甲醚的平均加标回收率分别为115.5%、98.1%、99.9%。

2.7 样品含量

测定结果表明，产自甘肃的马蹄大黄中芦荟大黄素、大黄酚、大黄素甲醚的含量分别为0.66 mg·g-1、1.98 mg·g-1、2.61 mg·g-1。

2.8 讨论

以往文献常用酸性水-甲醇[2]、TFA-HCN系统为流动相[3]。本研究采用甲醇-水为流动相，操作简便，出峰快，峰形对称，分离度高且实验后色谱柱易清洗，取得了满意效果。

3 结论

建立了同时测定大黄提取物中芦荟大黄素、大黄酚、大黄素甲醚含量的HPLC方法。结果表明，芦荟大黄素、大黄酚、大黄素甲醚分别在1.3～10.4 μg·mL-1、1.3～6.5 μg·mL-1、3.0～12.0 μg·mL-1范围内线性关系良好，R2分别为0.9997、0.9999、0.9992，平均加标回收率分别为115.5%、98.1%、99.9%。该方法操作简单、结果准确、灵敏度高，可用于大黄提取物的质量控制。

参考文献：

[1] 徐翔，郦柏平,张慧芬.大黄的研究进展[J].上海中医药杂志，2003，37(4)：56-59.

[2] 徐世霞.HPLC法测定枳实导滞丸中芦荟大黄素、大黄酸、大黄素、大黄酚及大黄素甲醚的含量[J].中国药师，2011，14(7)：971-973.

[3] 郑志华,祝晨蔯.HPLC法测定大黄提取物中5种蒽醌的含量[J].广东药学院学报，2004，20(6)：594-595.