大蒜素对腹主动脉缩窄大鼠左室肥厚及钙调神经磷酸酶信号通路的影响

廖家有 夏 勇

1.徐州医学院心血管病研究所，江苏 徐州 221006；2.徐州医学院附属医院心内科，江苏 徐州 221006

早期心肌肥大是为满足心脏做功需要而发生的代偿性变化，但长期持续的心肌肥大则可导致心功能失代偿而发生心衰。抑制或延缓心肌肥厚的发生是当前研究热点之一。钙调神经磷酸酶（calcineurin,CaN）是一种受Ca2+/钙调蛋白调节的丝/苏氨酸蛋白磷酸酶。研究发现，内皮素、血管紧张素等多种心肌肥大刺激因子都是通过CaN来发挥作用的[1]。近来的研究提示大蒜素可通过多种机制延缓高血压引起的心肌肥厚及纤维化[2-3]。本实验通过制作压力负荷大鼠心肌肥厚模型，观察大蒜素对心肌肥厚及CaN信号通路的影响，为大蒜素预防心血管疾病提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验动物 健康SD雌性大鼠50只，体重（200±30）g，由徐州医学院实验动物中心提供。

1.1.2 主要试剂 大蒜素由徐州莱恩药业股份有限公司提供，规格30 mg/支，生产批号0901241。缬沙坦胶囊由北京诺华制药有限公司生产，规格80 mg/粒，生产批号X0802。RIPA组织裂解液购于碧云天生物技术研究所。CaN-A一抗，GAPDH、C-fos一抗及碱性磷酸酶标记的二抗均购于中杉金桥公司。内皮素（ET1）、血管紧张素Ⅱ（AngⅡ）酶联免疫试剂盒购于上海亚培生物科技有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 动物模型与分组 取30只大鼠行腹主动脉缩窄术作为手术组。根据Rodriguez-Iturbe等[4]的方法，在双肾动脉上方分离一小段腹主动脉，用银夹造成腹主动脉部分缩窄（银夹内径0.7 mm）。术后3 d将大鼠随机分为模型组、大蒜素组和缬沙坦组，每组10只。再取10只大鼠作为假手术组，只分离腹主动脉，不用银夹缩窄。术后3 d开始给药，大蒜素组给大蒜素10 mg/（kg·d）腹腔注射；缬沙坦组给予缬沙坦 20 mg/（kg·d），以1 mL生理盐水混匀后灌胃；假手术组、模型组以1 mL生理盐水灌胃，给药6周。

1.2.2 血流动力学检测及血浆提取 术后6周，大鼠称重，麻醉，分离右侧颈总动脉逆行插管至左心室，记录左室收缩峰压（LVSP）、左室舒张末压（LVEDP）。经颈动脉导管取血 5 mL注入含 10%EDTA-2Na 30 μL 和抑肽酶 40 μL 试管中，4℃3 000 r/min离心10 min，分离血浆，-80℃保存备用。

1.2.3 左室肥厚指数及组织蛋白的提取 采血后处死动物，取出心脏，剪去出入心脏的大血管，称重即为心脏总重（HW），然后剪去左右心房及右室游离壁，保留左室心肌组织（包括左室游离壁及室间隔），再次称重即为左室重量（LVW）。计算左室肥厚指数（LVMI）=LVW（g）×1000/BW（g）。 取 200 mg 心肌组织加入2 mL RIPA组织裂解液进行匀浆，将匀浆液4℃12 000 r/min离心10 min，取上清定蛋白浓度后，煮沸变性，-20℃保存备用。

1.2.4 心肌的组织形态学观察 HE染色，石蜡切片厚度为5μm，光镜观察。

1.3 统计学方法

用Graphpad Prism 5.0统计软件进行数据分析，所有数据以均数±标准差（）表示，进行单因素方差分析，以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 血流动力学参数及血浆AngⅡ、ET1水平的比较

与假手术组相比，各手术组LVSP及LVEDP增加，大蒜素组及缬沙组LVSP较模型组低（P＜0.05），两给药组之间比较差异无统计学意义（P＞0.05），各手术组LVEDP比较差异无统计学意义（P＞0.05）。各手术组血浆AngⅡ、ET1水平明显高于假手术组，缬沙坦组AngⅡ增高最为明显（P＜0.01）。见表1。

表1 各组大鼠血流动力学参数及血浆血管紧张素Ⅱ、内皮素水平比较（）

表1 各组大鼠血流动力学参数及血浆血管紧张素Ⅱ、内皮素水平比较（）

注：与假手术组比较，＃P ＜ 0.05；与模型组比较，*P ＜ 0.05；1 mm Hg=0.133 kPa

组别 只数 LVSP（mm Hg）LVEDP（mm Hg）AngⅡ（ng/L）ET-1（ng/L）假手术组模型组大蒜素组缬沙坦组10 10 10 10 115.49±13.23 168.90±10.71#149.45±11.19#*138.30±14.48#*4.16±1.21 10.84±1.36#6.91±1.20#6.70±1.42#323.82±83.61 876.97±116.54#579.53±108.72#1 348.12±130.25#140.46±36.65 429.31±88.09#306.59±49.14#395.86±42.05#

2.2 心肌的组织形态学比较

假手术组细胞大小、形态较一致，结构清晰，间隙边缘清楚，肌纤维排列整齐。缬沙坦组心肌肥大较轻，心肌组织纹理结构尚整齐。大蒜素组心肌细胞增生肥大较假手术组明显，局部结构不清晰，细胞间隙变窄较缬沙坦组明显，细胞核数目则相对较少，纹理轻度紊乱。模型组心肌肥大最为明显，细胞边缘不清晰，呈融合状，胞核数目较多。见图1。

图1 各组大鼠心肌组织结构的对比（HE染色，×400）

2.3 左室肥厚指数、左室重量、心脏总重及体重的比较

各手术组LVW及LVMI明显增高，大蒜素组、缬沙坦组LVMI明显低于模型组。见表2。

2.4 CaN-A、C-fos蛋白水平表达

Western Blot检测心肌细胞CaN-A、C-fos蛋白水平的表达，用GAPDH为内参进行光密度校正（图2），结果示各手术组CaN-A、C-fos蛋白表达均高于假手术组（P＜0.05），两给药组低于模型组（P＜0.05），给药组之间无差异（P＞0.05）。

图2 钙调神经磷酸酶（CaN-A）、C-fos蛋白水平表达

3 讨论

在肾动脉上方使腹主动脉部分狭窄可以造成心脏后负荷的增加，心脏发生代偿性心肌肥厚，同时因为肾血流量的减少，可导致体内RAS系统的激活及多种肥大刺激因子含量升高，这些体液因子的增高一方面有利于维持心功能，另一方面成为细胞肥大的刺激因素。而CaN信号转导系统在上述肥大刺激因子信号传递网络中处于非常关键的位置。CaN激活后能活化多种心肌肥厚相关基因，并诱导细胞增殖相的原癌基因，如C-fos、C-jun等的表达，使心肌向胚胎化方向发展，细胞内蛋白合成增加，细胞外间质增多，细胞体积增大，最终导致心肌肥厚。因此，CaN在压力超负荷性心肌肥大中发挥着关键作用，是超负荷性心肌肥大的重要上游调节机制[5]，并且阻断CaN信号通路已经成为预防和治疗心肌肥厚及心衰的新靶点[6]。

本实验中各手术组血浆AngⅡ，ET1水平及心肌细胞中CaN-A、C-fos蛋白的表达均明显增高，其中缬沙坦组AngⅡ水平增高最为明显，这可能与缬沙坦在受体水平上阻滞AngⅡ的作用后反馈性引起RAS活性增加有关。本实验还从LVMI、左室心肌病理学形态等方面观察大蒜素对压力负荷大鼠心肌组织重塑的影响。病理结果显示，压力负荷增加引起的心肌肥厚属于向心性肥厚，室壁增厚且室腔容积减少明显，心肌细胞肥大，组织结构变紊乱。其中各手术组LVMI均高于假手术组，给药组同模型组比较，心肌肥厚有不同程度的减轻，缬沙坦组明显低于模型组，大蒜素组较模型组有降低趋势，但与缬沙坦组及模型组比较无差异（P＞0.05）。这说明大蒜素虽然对延缓心肌肥厚有一定的作用，但是作用效果不如缬沙坦明显。

表2 各组大鼠体重、左室重量（LVW）、心脏总重（HW）及左室肥厚指数（LVMI）的比较（）

表2 各组大鼠体重、左室重量（LVW）、心脏总重（HW）及左室肥厚指数（LVMI）的比较（）

注：与假手术组比较，＃P＜0.05；与模型组比较，*P＜0.05

组别 只数LVW（g） HW（g） LVMI体重（g）术时 术后6周假手术组模型组大蒜素组缬沙坦组10 10 10 10 202.56±13.34 203.50±10.01 209.47±11.78 207.22±13.23 332.45±22.38 317.00±13.08 325.10±21.40 304.44±20.68 0.53±0.07 0.87±0.15#0.72±0.06#0.69±0.10#0.80±0.11 1.16±0.19#1.02±0.08#0.99±0.13#1.62±0.21 2.71±0.16#2.31±0.14#*2.26±0.17#*

近年来的大量研究及荟萃分析表明，大蒜素具有降压、抗氧化、降脂、抗肿瘤等广泛的生物学活性，其在心脑血管疾病中的预防保健作用已得到国内外学者的广泛认同。目前对于大蒜素降压的具体机制仍不清楚。大多数学者认为，大蒜素降压的机制可能是抑制内皮素的合成和释放，使周围血中保持较低的内皮素水平，同时增强内皮细胞一氧化氮合酶活性，提高一氧化氮水平，从而防止血管痉挛，降低血管张力[7]。Sharifi等[8]则认为大蒜素的降压作用与拮抗血管紧张素转化酶有关。本实验表明大蒜素对延缓压力后负荷增加所致的心肌肥厚有一定的作用，其可能原因是通过降低血液循环中AngⅡ、ET1水平，降低血压，并同时减少对CaN信号通路的激活有关。

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[8]SharifiA，DarabiR，AkbarlooN.Investigationofantihypertensivemechanism of garlic in 2K1C hypertensive rat[J].J Ethnopharm，2003，86：219-224.