那格列奈分散片的人体生物等效性研究

程 志，于 洋，胡玉钦，侯艳宁

(白求恩国际和平医院药剂科，河北 石家庄 050082)

那格列奈(nateglinide)是一种新型非磺酰脲类促胰岛素分泌的降糖新药，为 D－苯丙氨酸衍生物，通过与胰腺β细胞膜上的ATP敏感性钾通道(KATP)偶联受体相互作用，刺激胰岛素分泌，临床用于治疗2型糖尿病，具有起效快、作用时间短、耐受性好、心血管不良反应和低血糖发生率低等特点[1－3]。本试验中以合资公司生产的那格列奈片为参比制剂，研究了国产那格列奈分散片的人体生物等效性，旨在为药品注册和临床合理用药提供依据。

1 仪器与试药

Agilent 1100高效液相色谱系统，含在线脱气机、四元梯度泵、自动进样器、柱温箱(美国安捷伦公司);API 4000型三重四级杆质谱仪，Analyst 1.4软件(美国ABI公司);DAS药物代谢动力学专用程序。受试制剂那格列奈分散片(石药集团中诺药业＜石家庄＞有限公司，批号为041101，规格为每片30 mg);参比制剂那格列奈片(商品名为唐力®，北京诺华制药有限公司，批号为04008，规格为每片120 mg);那格列奈对照品(河北省药品检验所，批号为040801，含量为99.5%);地西泮对照品(内标，中国药品生物制品检定所，批号为171225－9601);甲醇、乙腈(色谱纯)，甲酸、乙醚(分析纯)，试验用水为市售娃哈哈纯净水。

2 方法与结果

2.1 研究对象选择

选择健康志愿者20名，男，无烟酒嗜好，年龄(22±1)岁，体重(63±6)kg，身高(172±5)cm。试验前经病史询问和体格检查，心电图、胸部X线透视、血常规、尿常规、肝功能、肾功能等均正常。试验前2周及试验期间未服用其他药物。试验前受试者均签署知情同意书。

2.2 给药方案和样品采集

采用两制剂两周期交叉试验设计。将20名受试者随机分为2组，交叉服用参比制剂或受试制剂。受试者于试验前进食清淡晚餐后禁食10 h过夜，试验当日早晨空腹口服参比制剂或受试制剂，剂量均为120 mg，用温开水250 mL送服。服药2 h后方可饮水，4 h和10 h后统一进餐。试验期间保持日常轻微活动，避免剧烈活动。清洗期为1周。受试者于服药前及服药后0.33，0.67，1，1.5，2，2.5，3，4，6，8，10 h 分别从肘静脉取血 2 mL，置肝素抗凝管中，离心分离血浆，－20℃冷冻保存至用。试验方案经白求恩国际和平医院伦理委员会批准实施。

2.3 血浆样品分析方法

2.3.1 色(质)谱条件与系统适用性试验

色谱柱为 Symmetry Shield RP18柱(20 mm × 3.9 mm，3.5 μm);流动相为甲醇－0.5%甲酸水溶液(80∶20，V/V);流速0.5mL/min;柱温20℃;进样量5 μL。质谱分析采用电喷雾离子化(ESI)源;负离子多离子反应监测(MRM)模式检测;喷雾电压为－4.5 kV;雾化温度为450℃;雾化气流速为35 L/min;帘气流速为25 L/min;碰撞气流速为4 L/min;辅助气流速为35 L/min。用于定量分析的离子反应分别为 m/z 318→m/z 166(那格列奈，[M－H]－)，m/z 258→ m/z 193(内标，地西泮，[M －H]－)，碰撞诱导解离(CID)电压分别为20 V(那格列奈)和40 V(内标，地西泮);驻留时间均为200 ms。上述色(质)谱条件下，血浆中内源性物质不干扰那格列奈及内标物的测定，那格列奈和内标物的保留时间分别为 0.95 min 和 0.65 min，色谱图见图 1。

图1 测定血浆中那格列奈的典型色谱图

2.3.2 血浆样品处理

取血浆样品 100 μL，依次加入内标工作液(1.0 μg/mL 地西泮水溶液)100 μL，水 0.5 mL，0.1 mol/L 的 HCl溶液 200 μL，再加入乙醚3 mL，涡流混合 1.0 min，1800×g离心10 min后，取上层有机相至另一干燥试管中，40℃水浴挥干，残留物用1.0 mL流相动溶解，进样5 μL用于 LC－MS/MS分析。

2.3.3 方法学考察

标准曲线制备:取空白血浆，分别加入不同质量浓度的那格列奈对照品溶液，制备成 10.00，3.00，1.00，0.30，0.10 和 0.05 mg/L的血浆样品，按2.3.2项下方法操作后进样分析，以血浆样品中那格列奈质量浓度(C，mg/L)为横坐标、那格列奈与内标的峰面积比(Y)为纵坐标，采用加权(1/C2)最小二乘法进行线性回归[4－5]。回归方程为 Y=1.724 C+1.522 × 10－2，r=0.9994(n=6)，血浆中那格列奈的质量浓度在0.05～10 mg/L范围内与内标物的峰面积呈良好线性关系，最低定量限为0.05 mg/L。

回收率和精密度试验:取低、中、高(0.1，1，8 mg/L)3 个质量浓度的含那格列奈血浆样品，按照标准曲线制备项下方法操作，于1 d内和连续4 d处理并测定，每日各6份，计算日内、日间变异(RSD)及相对回收率。另分别配制上述3个质量浓度的那格列奈对照品溶液，按血浆处理方法不经萃取直接进样，记录色谱图和峰面积，与相应质量浓度的血浆样品测得的峰面积进行比较得绝对回收率。结果见表1。

表1 回收率和精密度试验结果(n=6，%)

稳定性试验:取低、中、高(0.1，1，8 mg/L)3 个质量浓度的含那格列奈血浆样品，每个质量浓度各2份，分别考察上述样本在室温放置24 h，经3次冻融循环及－20℃冷冻保存2周的稳定性。结果那格列奈血浆样品室温放置24 h，经3次冻融循环及－20℃冷冻保存2周相对偏差均小于10%，表明在上述条件保存稳定。

2.4 血药浓度和主要药物代谢动力学参数

20名健康受试者口服单剂量参比制剂和受试制剂120 mg后的平均血药浓度－时间曲线见图2，主要药物代谢动力学参数和相对生物利用度见表2。

图2 平均血药浓度－时间曲线

表2 主要药物代谢动力学参数(n=20)

2.5 生物等效性检验

非参数秩和检验结果表明受试制剂的达峰时间(tmax)与参比制剂存在显著性差异，口服受试制剂后达峰较快;峰浓度(Cmax)、0～10 h药时曲线下面积(AUC0－10)、0～∞药量曲线下面积(AUC0－∞)经对数转换后进行方差分析，2种制剂lnAUC0－10h差异无统计学意义，而lnAUC0－∞和lnCmax的差异均有统计学意义，口服受试制剂后 Cmax值较高、AUC0－∞值较低。双单侧 t检验结果表明，受试制剂与参比制剂具有生物等效性，其lnCmax的90%置信区间为104.6% ～130.3%(落在参比制剂的75% ～133%之间);lnAUC0－10h和 lnAUC0－∞的 90% 置信区间分别为 88.7% ～ 99.5%和88.2% ～99.4%(均落在参比制剂的80% ～125%之间)。

3 讨论

本试验采用专属、灵敏、准确的高效液相色谱－质谱/质谱法测定健康人口服那格列奈后的血药浓度。当口服剂量为120 mg时，平均最大血药浓度值约为10 mg/L，每个样品测定时间不足2 min，样品处理采用以乙醚为提取溶剂的液液提取法，操作简单、快捷，适用于人体药物代谢动力学研究。

试验结果显示，那格列奈片口服给药吸收迅速，血药浓度较低，半衰期短，消除迅速。单剂量口服参比制剂和受试制剂后在健康人体内的过程略有差异，受试制剂为分散片，口服后达峰较快、最大血药浓度(Cmax)值较高，而药物在体内吸收的程度相当(AUC0－10，P ＞0.05)或略低(AUC0－∞，P ＜ 0.05)。

双单侧 t检验结果表明，两种制剂具有生物等效性，受试制剂的相对生物利用度为(94.9±14.4)%，表明受试制剂在临床使用可望取得与参比制剂相同的疗效。部分受试者服药后出现一过性头晕、乏力、出虚(冷)汗等症状，但均可耐受，无人因不良反应而终止试验。

[1]Tentolouris N，Voulgari C，Katsilambros N.A review of nateglinide in the management of patients with type 2 diabetes[J].Vasc Health Risk Manag，2007，3(6):797－807.

[2]黄晓程，贤晓丽.新型降糖药那格列奈的药理作用和临床应用[J].中国新药与临床杂志，2005，24(2):148－150.

[3]杨惠娣，徐 彬.2型糖尿病治疗新药那格列奈[J].世界临床药物，2004，25(9):564 －567.

[4]钟大放.以加权最小二乘法建立生物分析标准曲线的若干问题[J].药物分析杂志，1996，16(5):343 －346.

[5]于 洋，刘建芳，薛洪源，等.液相色谱－电喷雾质谱联用法测定人血浆中托吡酯[J].药物分析杂志，2004，24(4):358－361.