乙基纤维素固定化α-淀粉酶的研究

郭 青,周小凡

(南京林业大学轻工科学与技术学院，江苏 南京 210037)

α-淀粉酶(EC.3.2.1.1)在动物、植物及微生物中均有分布，可随机作用于淀粉、糖原、多聚糖或寡糖分子的α-1,4葡萄糖苷键，将其降解为葡萄糖、麦芽糖和低聚糖等，是应用最早、最广泛的工业酶制剂之一，其应用涉及食品工业、酿造发酵工业、纺织品工业、造纸工业和医药工业等多个领域[1～6]。α-淀粉酶虽可从动物、植物中提取，但其大规模化工业生产仍然采用微生物发酵法。乙基纤维素(Ethyl cellulose，EC)因其优良的抗水性、成膜性和化学惰性，广泛用于药物骨架、包衣材料、包囊辅材、载体材料、片剂粘合剂[7～9]等药物制剂的制备。作者在此采用物理包埋技术，以PVA海绵作为载体，在其充分吸收α-淀粉酶后，反复浸泡吸收EC溶液，待EC干燥后即在载体表面及内部形成一层薄膜，从而完成对α-淀粉酶的固定化。并研究了固定化α-淀粉酶的特性。

1 实验

1.1 材料、试剂与仪器

PVA海绵，宁波智德清洁用品有限公司。裁剪成3 mm×3 mm×3 mm的小颗粒，备用。

α-淀粉酶，北京奥博星生物技术有限责任公司；乙基纤维素(M70)，国药集团化学试剂有限公司；其余试剂均为分析纯，国药集团。

HH-S型恒温水浴锅，上海叶拓仪器仪表有限公司；7230G型分光光度计，上海精密科学仪器有限公司；PHS-3C型数显pH计，上海康仪仪器有限公司；电子天平(Max=120 g,d=0.1 mg)，赛多利斯科学仪器(北京)有限公司；JJ-791型磁力搅拌器，江苏金坛宏凯仪器厂。

1.2 固定化方法

取1 gα-淀粉酶放入100 mL去离子水中于40 ℃恒温活化30 min，过滤，去除杂质；EC用乙酸乙酯配制成0.50%的溶液。

将1 mL活化的α-淀粉酶与50 mg PVA海绵放入烧杯中，反复挤压混匀2 min，使PVA海绵充分吸收酶液；再将PVA海绵挤干，经流动空气干燥至含水量约80%；将吸收了酶液的PVA海绵转移入烧杯，加入2 mL 0.50%(质量分数，下同)EC溶液，反复挤压3 min左右，使PVA海绵与EC溶液充分混合，然后放入4 ℃冰箱中干燥；再浸泡吸收EC溶液，进行二次固定化和干燥，即得固定化α-淀粉酶。

1.3 酶活测定

α-淀粉酶的活力采用碘-淀粉比色法测定[10]。

α-淀粉酶活力单位定义:40 ℃下，100 mL酶滤液(1 g酶粉)中的酶与底物淀粉作用30 min，水解10 mg淀粉为1个酶活力单位。

2 结果与讨论

2.1 固定化工艺条件的优化

2.1.1 干燥方式对固定化α-淀粉酶的影响

固定化α-淀粉酶的固定化干燥过程实质上是乙酸乙酯溶剂蒸发的过程，也是EC从液相转化为固相的成膜过程。随着乙酸乙酯溶剂的蒸发，EC体系粘度逐渐增大，直至最后成为固体。

保持其它固定化条件不变，将α-淀粉酶分别在室温25 ℃和冰箱4 ℃条件下干燥，考察不同干燥方式对固定化α-淀粉酶重复操作稳定性的影响，结果见图1。

图1 干燥方式对固定化α-淀粉酶的重复操作稳定性的影响

由图1可看出，在室温25 ℃干燥时，固定化α-淀粉酶的重复操作稳定性较差，相对酶活较低，并随着重复操作次数的增加而持续下降；在冰箱4 ℃干燥时，首次相对酶活很高，达到130%左右，自第2次开始有所下降，但基本维持在较稳定的水平。与室温25 ℃干燥方式相比，4 ℃干燥的固定化α-淀粉酶在重复操作稳定性方面有着明显的优势，经多次重复使用后仍有活力。这是由于，乙酸乙酯在4 ℃时的蒸发速度较25 ℃时的蒸发速度慢，使得4 ℃下成膜的EC具有更小、更致密的膜孔，在PVA海绵内部及表面的α-淀粉酶不易泄漏，从而表现出更好的重复操作稳定性。因此，选择冰箱4 ℃的干燥方式。

2.1.2 EC质量分数对固定化α-淀粉酶的影响

保持其它固定化条件不变，将EC用乙酸乙酯配制成不同质量分数：0.25%、0.50%、0.75%、1.00%、1.25%、1.50%，考察EC质量分数对固定化α-淀粉酶重复操作稳定性的影响，结果见图2。

图2 EC质量分数对固定化α-淀粉酶重复操作稳定性的影响

由图2可看出，EC质量分数较低(0.50%)时，固定化α-淀粉酶的相对酶活较高，重复操作性较好；随着EC质量分数的升高，相对酶活逐渐下降；当EC质量分数超过0.75%后，固定化α-淀粉酶的重复操作稳定性较好，但相对酶活普遍较低。这可能与PVA海绵内部孔道是否畅通有关，当EC质量分数较高时，PVA海绵孔道中因过多的EC而造成堵塞。由图2还可看出，固定化α-淀粉酶经过第1次反应后，第2次的相对酶活大幅下降，这可能是由于，第1次反应时生成的产物及反应底物将PVA海绵内部孔道进一步堵塞，从而导致2次操作后的相对酶活下降。综合考虑α-固定化酶活力和重复操作稳定性，选择EC质量分数为0.50%。

2.1.3α-淀粉酶浓度对固定化α-淀粉酶的影响

保持其它固定化条件不变，将α-淀粉酶酶液配成一系列不同浓度(g·L-1)：1、2、3、4、5、6、7，考察α-淀粉酶浓度对固定化α-淀粉酶重复操作稳定性的影响，结果见图3。

图3 α-淀粉酶浓度对固定化α-淀粉酶重复操作稳定性的影响

由图3可看出，在第1次操作时，随着α-淀粉酶浓度的增大，固定化酶活力有所提高，但是酶液浓度超过2 g·L-1后，固定化酶活力随着酶液浓度的增大反而略有下降。这可能与PVA海绵载体的酶负载量有关。当PVA海绵的酶负载量达到饱和时，固定化酶表现出最大活力。由图3还可看出，酶液浓度较高时，均表现出较好的重复操作稳定性。综合考虑固定化α-淀粉酶活力和重复操作稳定性，选择α-淀粉酶浓度为4 g·L-1。

2.2 固定化α-淀粉酶的性质

2.2.1 最适反应pH值

40 ℃下，选取不同pH值的淀粉溶液分别与游离α-淀粉酶和固定化α-淀粉酶反应，考察游离α-淀粉酶和固定化α-淀粉酶的最适反应pH值，结果见图4。

图4 游离酶和固定化酶的最适反应pH值

当酶被固定在某一介质内部或载体表面时，由于载体的特性不同，pH值对酶活力的影响也不一样[11]。由图4可看出，游离α-淀粉酶的最适反应pH值为6.0，而固定化α-淀粉酶的最适反应pH值为7.0，α-淀粉酶经固定化后，最适反应pH值往碱性方向移动了1个单位。因此，后续固定化α-淀粉酶性质检测均在pH值7.0的条件下进行。

2.2.2 最适反应温度

在pH值为6.0的条件下，考察游离α-淀粉酶和固定化α-淀粉酶在30～70 ℃的酶活力，结果见图5。

图5 游离酶和固定化酶的最适反应温度

由图5可看出，游离α-淀粉酶的最适反应温度为50 ℃，固定化α-淀粉酶的最适反应温度为60 ℃。相对游离α-淀粉酶，固定化α-淀粉酶的最适反应温度升高了近10 ℃，且在各温度点都表现出更高的酶活力。可见，α-淀粉酶经固定化后，最适反应温度有所提高，在60 ℃时活力达到最高。

2.2.3 热稳定性

分别将固定化α-淀粉酶和游离α-淀粉酶放在70 ℃烘箱中保温，每隔20 min取出部分样品，冷却至室温25 ℃，测定酶活力，结果见图6。

图6 70 ℃下游离酶和固定化酶的热稳定性

由图6可看出，随着保温时间的延长，固定化α-淀粉酶和游离α-淀粉酶的酶活力都逐渐下降；保温140 min后，游离α-淀粉酶已近完全失活，而固定化α-淀粉酶仍保持初始酶活的40%左右。可见，α-淀粉酶经固定化后热稳定性得到了提高。这可能与固定化方法有关，相比共价固定或物理吸附固定，经包埋固定的酶的热稳定性大多会得到提高[12]。

2.2.4 重复使用性

固定化酶的重复使用性是衡量固定化酶性质的重要指标之一。在pH值7.0、25 ℃下，用纱网过滤取出固定化α-淀粉酶，用蒸馏水冲洗3次，以去除表面的底物和产物溶液，然后重复使用，测其酶活。连续重复使用10次的结果见图7。

图7 固定化α-淀粉酶的重复使用性

由图7可看出，第1次使用时酶活力很高；第2次使用时酶活力大幅下降，但仍保持在一个较高的水平；从第7次使用开始酶活力又进一步逐渐下降。这可能是由于，酶部分泄漏或者传质通道被底物或产物堵塞，减少了酶与底物接触的机会，增大了扩散限制对固定化α-淀粉酶活力的影响，从而导致固定化α-淀粉酶的活力下降。这表明，以PVA海绵为载体，再以EC包裹载体包埋制得的固定化α-淀粉酶具有一定的重复使用性。

2.2.5 储存稳定性

将游离α-淀粉酶和固定化α-淀粉酶储存于4 ℃冰箱中，每隔4 d检测一次酶活力，结果见图8。

图8 游离酶和固定化酶的储存稳定性

由图8可看出，固定化α-淀粉酶和游离α-淀粉酶的活力均随着储存时间的延长而降低，储存32 d后，固定化α-淀粉酶仍能保持初始酶活的60%左右，而游离α-淀粉酶只保留初始酶活的4%左右。可见，α-淀粉酶经固定化后储存稳定性显著提高。

3 结论

以PVA海绵作为载体，充分吸收α-淀粉酶后，反复浸泡吸收EC溶液，待EC干燥后即在载体表面及内部形成一层薄膜，从而完成对α-淀粉酶的固定化。该方法操作简便，减少了酶变性的可能，最大程度保留了酶活力。此法制得的固定化α-淀粉酶具有良好的热稳定性、重复使用性和储存稳定性，其最适反应pH值为7.0、最适反应温度为60 ℃。该方法理论上适用于所有酶的固定化，并且可以使用其它成膜材料代替EC，具有广阔的应用前景。

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