大鼠血浆中绿原酸和木犀草苷的HPLC法测定

沈 熊， 梁 健， 杨春欣， 吕迁洲

(复旦大学附属中山医院药剂科，上海200032)

咽炎合剂为本院自制制剂，临床应用已十余年，疗效确切，副作用小。本品由金银花、射干、山豆根、甘草、陈皮五味中药组成，具有清热解毒、消炎止痛，用于急、慢性咽炎及扁桃体炎等。金银花是咽炎合剂的主药，为忍冬科植物忍冬Lonicera japonica Thunb.的干燥花蕾或带初开的花［1］。金银花中含有机酸、黄酮类、挥发油、三萜类、苷类、微量元素等成分，其中活性成分是绿原酸(Chlorogenic acid)为代表的有机酸类以及木犀草苷 (Luteoloside)为代表的黄酮类成分［2-3］。二者的研发报道较多［4-6］，而同时测定其在血浆中质量浓度则尚未见报道。LC-MS法用于分析生物样品，在灵敏度和特异性方面有很大优势，但该仪器昂贵，本实验建立了HPLC法，并优化色谱和血浆处理条件，以槲皮素 (Quercetin)为内标，测定大鼠灌胃后体内绿原酸和木犀草苷的质量浓度，并计算药动学参数，为咽炎合剂的进一步研发提供参考。

1 仪器与试药

Agilent 1200高效液相系统 (G1312A二元泵、G1329A自动进样器、G1314D可见紫外光检测器等)，Agilent ChemStation B.04.02工作站。

绿原酸对照品 (10713-205213)，木犀草苷对照品 (1112061200302)和内标槲皮素对照品(1113202101216)由中国食品药品检定研究院提供，甲醇为色谱纯，其余试剂均为分析纯，试验用水为二次蒸馏水。样品咽炎合剂 (批号20110403)，本院自制。

SPF级SD大鼠，体质量155～175 g，由上海西普尔-必凯动物有限公司提供，动物许可证:SCXK(沪)2008-0016，实验前适应1周。

2 方法与结果

2.1 溶液配制 对照品贮备液:精密称取绿原酸对照品适量，加甲醇溶解，制得质量浓度为850 g/L的绿原酸对照品贮备液，同法制得质量浓度为1010 g/L的木犀草苷对照品贮备液。避光，4℃冰箱中保存，使用前用甲醇稀释至所需浓度。

内标溶液:精密称取槲皮素对照品适量，参照上述方法制得质量浓度为360 g/L的槲皮素内标贮备液。

2.2 色谱条件 Phenomenex Luna C18柱 (150 mm×4.6 mm，5.0 μm)，流动相为0.4%醋酸溶液(A)-甲醇 (B)，B泵的比例0～40 min从10%上升到80%，体积流量1.0 mL/min;检测波长350 nm;柱温30℃，进样量20 μL。

2.3 血浆样品预处理 精密吸取血浆样品200 μL，置10 mL具塞试管中，精密加入内标溶液10 μL，漩涡30 s，加入叔丁基甲醚2 mL，漩涡混合2 min，5000 r/min离心5 min，取上清液，50℃水浴中氮气吹干，以甲醇 －0.4%醋酸溶液(50∶50)200 μL溶解残渣，5000 r/min离心 5 min，取 100 μL 进样。

2.4 专属性试验 分别取混合对照品溶液、大鼠空白血浆、空白血浆加入绿原酸、木犀草苷和槲皮素，以及大鼠给药后30 min后的血样，进行测定，色谱图见图1。结果表明，绿原酸、木犀草苷和槲皮素与其它组分分离良好，血浆中内源性物质和代谢产物不干扰测定，结果见图1。

图1 绿原酸、木犀草苷和檞皮素的HPLC图谱Fig.1 HPLC chromatograms of chlorogenic acid in rat plasma

2.5 线性范围 取大鼠空白血浆200 μL，加入10、40、80、120、160、200 g/L系列质量浓度对照品绿原酸溶液10 μL，混匀;再分别加入2、10、20、30、40和50 g/L系列质量浓度对照品木犀草苷溶液10 μL，混匀，则血浆中绿原酸质量浓度分别为0.5、2、4、6、8和10 g/L，木犀草苷质量浓度分别为0.1、0.5、1、1.5、2和2.5 g/L，按2.3项下方法处理，进行测定，记录色谱图。分别以绿原酸、槲皮素峰面积之比 (R1)以及木犀草苷、槲皮素峰面积之比 (R2)为纵坐标，质量浓度C为横坐标，进行线性回归，得回归方程为R1=3.61C+0.128，r=0.999;R2=5.06C+0.296，r=0.999，表明血浆中绿原酸和木犀草苷分别在0.5～10 g/L和0.1～2.5 g/L范围内线性关系良好，绿原酸和木犀草苷的定量限分别为为0.5 g/L和0.1 g/L。

2.6 回收率试验 同上配制含绿原酸和木犀草苷高、中、低质量浓度的血样，各5份，按2.3项下方法处理，进行测定，记录绿原酸、木犀草苷和槲皮素的峰面积，将绿原酸、槲皮素以及木犀草苷、槲皮素比值分别代入各自回归方程，计算相对回收率，结果见表1。

2.7 精密度试验 同上配制含绿原酸和木犀草苷高、中、低质量浓度的血样，各5份，按2.3项下方法处理，于1 d内进行测定，记录绿原酸、木犀草苷和槲皮素的峰面积，将绿原酸、槲皮素以及木犀草苷、槲皮素比值分别代入各自回归方程，计算日内变异。上述各浓度样品连续测定5 d，同上计算日间变异。结果见表2。

表1 绿原酸和木犀草苷相对回收率试验结果Tab.1 Recovery rate of chlorogenic acid and luteoloside

表2 绿原酸和木犀草苷精密度试验结果Tab.2 Intra-day and inter-day precision of chlorogenic acid and luteoloside

2.8 药动学试验 大鼠6只，雌雄各半，实验前禁食12 h，自由饮水，按10 mL/kg剂量灌胃给药，给药后 5、15、30、60、120、240、360、480 min于眼底静脉丛采血，置1.5 mL肝素抗凝离心管，4000 r/min离心10 min，分离出血浆，－80℃冷冻保存待测。

按2.3项下方法处理血浆，测定绿原酸和木犀草苷在大鼠体内的平均血药浓度，药—时曲线见图2，用WinNonlin(Ver 4.1，Pharsight，USA)软件处理，绿原酸和木犀草苷呈非房室模型，采用非房室模型 (统计矩)计算结果，主要药动学参数见表3。

图2 绿原酸和木犀草苷的药—时曲线Fig.2 Mean drug plasma concentration-time profiles of chlorogenic acid and luteoloside

表3 主要药动学参数Tab.3 Main pharmacokinetic data

3 讨论

绿原酸为金银花活性成分，常用作药材和制剂的质量控制指标。木犀草苷是金银花区别山银花的特征成分，具有较强的抗呼吸道合胞体病毒活性，是其抗菌抗病毒的有效成分之一。因此，在金银花药材提取工艺、制剂质量标准、以及药效监测研究中，不能仅以单一成分为指标进行评价，应结合药理研究，选择合理的指标，以保证方法的可行性和药效。

在色谱条件的选择上，参考绿原酸和木犀草苷的最大吸收波长分别为330 nm［7-8］和350 nm文献［4，6］，也有文献采用 350 nm 检测绿原酸等成分［9］，实验中比较两种波长测定绿原酸，发现积峰面积相差不超过5%，采用350 nm测定绿原酸，可以达到本次实验的要求，因此设置统一波长测定绿原酸和木犀草苷，使实验更加简便易行。合剂作为中药制剂的典型，其成分十分复杂，给测定带来一定困难，在测定前，必须对样品进行分离纯化处理［10］。经参考文献［11-12］及根据实际操作结果不断改进，最终确定了HPLC法测定绿原酸和木犀草苷的含量的方法。

从药—时曲线和药动学参数上看，绿原酸和木犀草苷在体内的浓度差别很大，但变化趋势相似，吸收快速，两者均呈现非房室模型。

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