某地区不同采收期连翘叶中连翘酯苷、芦丁和连翘苷的含量测定

王雨虹，贺爱玲

(1.中铁十七局医院，山西 太原 030032;2.山西中医院，山西太原 030012)

连翘叶是木犀科植物连翘的干燥叶，主要含有连 翘苷、连翘酯苷、芦丁、右旋松脂酚等化学成分［1］。有清热解毒作用，主治心肺积热;曾有研究显示，连翘属植物叶子与果实的成分有较好的一致性，叶子中有效成分如木质素、咖啡碱和糖苷等的含量较果实中高。连翘叶在我国民间药用己有较长历史，我国河北、河南和陕西等地民间将连翘叶制作成保健茶饮用已有较长历史，连翘叶具有十分广泛的药用价值。

为了确定连翘叶最佳的采收期，以连翘叶中含有的、已知具有较好生理活性的连翘酯苷、芦丁和连翘苷3种物质为指标，测定了不同采收期的连翘叶中连翘酯苷、芦丁和连翘苷的含量，期望对连翘叶资源的开发提供科学依据。

1 仪器与试剂

Waters515二元液相色谱泵;Waters2996型光电二极管阵列检测器;万分之一天平 FA/JA1004型;十万分之一天平 METTLER TOLEDO AB135-S;KQ5200V型超声波清洗机。

连翘叶(由中药系鉴定教研组裴香萍老师鉴定)采自山西中医学院校园，由于连翘先花后叶，所以在叶子生长茂盛的6月份开始采摘，采摘期至10月中旬。连翘苷(批号:110821-200610)、连翘酯苷对照品(批号:100080-200707)均购自中国药品生物制品鉴定所;芦丁对照品(经高效液相检测，纯度大于98%)购自辽宁省生物医药研究所;实验用水为双蒸水(购自太原理工大学分析测试中心)和蒸馏水;甲醇为色谱纯(天津市光复精细化工研究所)，甲醇为分析纯(天津市科密欧化学试剂有限公司)，0.45 μm微孔滤膜。

2 方法与结果

2.1 色谱条件［2］

色谱柱:Alltima C18ODS(250 mm × 4.6 mm，5 μm);流动相:甲醇－水，梯度洗脱条件见表1;检测波长280 nm;流速0.8 mL/min;柱温为室温。在上述色谱条件下对照品和供试品溶液各色谱峰的分离度良好，其他峰对连翘酯苷、芦丁和连翘苷的含量测定无干扰。色谱图见图1。

表1 流动相梯度洗脱条件Table 1 The Condition of Elution of the Mobile Phase Gradient

图1 HPLC色谱图Fig 1 HPLC Chromatograms of Control Products and Samples(1.rutin;2.phillyrin;3.forsythiaside)

2.2 对照品溶液的制备

精密称取芦丁对照品1.63 mg和连翘苷对照品2.93 mg置于10 mL容量瓶中，甲醇溶解并定容至刻度，摇匀，得到储备液。精密称取连翘酯苷对照品2.94 mg，置于2 mL容量瓶中，用0.163 mg/mL的芦丁对照品和0.293 mg/mL的连翘苷对照品混合溶液溶解并定容至刻度，摇匀。制成连翘酯苷浓度为1.47 mg/mL、芦丁浓度为0.163 mg/mL、连翘苷浓度为0.293 mg/mL的混合对照品溶液。

2.3 供试品溶液的制备

将不同月份采集的连翘叶自然晾干，粉碎，得粗粉，称取0.4 g，精密称定，置50 mL具塞锥形瓶中。精密加入50%甲醇20 mL，称重，超声提取30 min，放冷，用50%甲醇溶液补足重量，摇匀，上清液滤过，取续滤液即得。

2.4 标准曲线

精密吸取上述混合对照品溶液4.0 μL，6.0 μL，8.0 μL，10.0 μL，12.0 μL，14.0 μL，分别按照“2.1”项方法进样测定，以进样量对峰面积作图，计算回归方程，结果表明连翘酯苷、芦丁和连翘苷在各自的线性范围内线性关系良好。结果见表2。

表2 连翘酯苷、芦丁和连翘苷在各自的线性范围内线性关系(n=6)Table 2 Linear Relation in Linear Range of Rutin，Phillyrin and Forsythiaside(n=6)

2.5 精密度试验

精密吸取制备好的连翘酯苷、芦丁、连翘苷混合对照品溶液10.0 μL，按照“2.1”项方法进样测定，分别重复进样6次，测得其峰面积，经计算连翘酯苷、芦丁、连翘苷峰面积的 RSD值分别为1.13%、1.07%、0.91%，表明仪器精密度良好。结果见表3。

表3 精密度测定结果(n=6)Table 3 Determination Results of Precision(n=6)

2.6 稳定性试验

精密吸取在室温下放置的供试品溶液10.0 μL，按照“2.1”项方法分别测定，在0 h，3 h，6 h，9 h，12 h分别进样，记录相应保留时间峰的峰面积，计算连翘酯苷、芦丁、连翘苷峰面积的 RSD值分别为0.99%、1.44%、1.25%，说明供试品溶液在12 h内稳定。结果见表4。

表4 稳定性测定结果(n=5)Table 4 Determination Results of Stability(n=5)

2.7 重复性试验

取同一批连翘叶药材0.2 g，分取6份，精密称定，按“2.3”项方法制备，按照“2.1”项的色谱条件分析测定，计算连翘酯苷、芦丁、连翘苷重复性的RSD值分别为0.90%、0.46%、1.06%，说明该方法重复性良好。结果见表5。

表5 重复性测定结果(n=6)Table 5 Determination Results of Repeatability(n=6)

2.8 样品中连翘酯苷、芦丁、连翘苷的含量测定

取不同采收期的连翘叶1 g，精密称定，按照“2.3”项方法制备样品溶液，按“2.1”项的色谱条件测定样品。结果见表6。

表6 不同采摘时期样品中连翘酯苷、芦丁、连翘苷的含量 mg/gTable 6 Contents of Rutin，Phillyrin and Forsythiaside in Samples Gathered in Different Periods mg/g

2.9 加样回收率试验

取同一批已知含量的连翘叶粉末6份各0.1 g，精密称定，每份加入混合标准品溶液按上述制备样品的方法处理样品，在上述色谱条件下分析测定。计算连翘酯苷、芦丁、连翘苷的平均回收率为99.53%、98.92%、99.99%，RSD 值分别为0.79%、0.75%、2.91%。实验结果表明，该方法有较好的准确度。回收率测定结果见表7。

表7 回收率测定结果(n=6)Table 7 Determination Results of Recovery Rate(n=6)

3 讨论

由本实验结果可以看出，太原地区连翘叶中连翘酯苷、芦丁和连翘苷在6月底和7月份含量最高，8、9、10月份含量逐渐下降，所以连翘叶的最佳采收期应该以6月底和7月份为佳，这也说明民间采集幼嫩的连翘叶作为保健茶原料是有一定科学依据的。曾有人利用薄层扫描法对不同采收时期连翘叶中连翘苷的变化情况进行过研究［3］，实验结果显示，连翘苷在5月份含量最高，随生长期延长而逐渐降低，与本研究的实验结果稍有不同，可能与材料来源不一致所导致有关。他们的实验采集的连翘叶来源于不同的年份，样品存储时间不一致，本研究的材料均选用2008年样品，可以保证结果的可信性。

连翘苷是2005版药典规定的连翘药材的质控指标之一，连翘酯苷是连翘具有抗病毒抗氧化作用的重要活性组分之一［4，5］，芦丁具有抗氧化、降低毛细血管脆性与通透性等多种活性，所以选择上述3种物质作为指标物质可以较为全面的反映连翘叶的品质。

连翘果实是我国传统上最为常用的清热解毒药之一。有研究表明，连翘属植物叶子与果实的成分有较好的一致性，而且叶子中的有效成分如木质素、咖啡碱糖苷等的含量较果实中高［6］，所以对连翘叶资源的开发有较好的前景，同时对于连翘叶能否代替连翘果实入药也是一个值得研究的课题。

本实验采用HPLC法对不同采收期的连翘叶中连翘酯苷、芦丁和连翘苷含量进行测定及对比研究，结果表明不同时期采收的连翘叶中连翘酯苷、芦丁和连翘苷的含量具有显著差异，为确定连翘叶的合适采收期提供了依据，同时对增加连翘中连翘苷和连翘酯苷药物的来源有一定的帮助。

［1］中华本草编辑委员会.中华本草［M］.上海:上海科学技术出版社，1999.

［2］Hui Guo，Ai Hualiu，Lie li，et al.Simultaneous Determination of 12 Major Constituents in Forsythia Suspensa by High Performance Liquid Chromatography-DAD Method［J］.Pharm Biomed Anal，2007，43(3):1000-1006.

［3］朱风云，陈志红，王 东，不同采收时间对连翘中连翘苷含量的影响［J］.河南中医药学刊，2002，43(3):1000-1006.

［4］胡克杰，徐凯建，王跃红.连翘酯苷体外抗病毒作用的试验［J］.中国中药药科技，2001，8(2):89.

［5］张立伟，赵春贵，杨 频.连翘酯苷抗氧化活性及构效关系研究［J］.中国药学杂志，2003，38(5):334-336.

［6］丁 冈，刘延泽.中药连翘及其同属植物的研究近况［J］.中药材，1994，17(10):42-44.