天津地区鲍曼不动杆菌16SrRNA甲基化酶基因的检测与耐药性分析

张利娟 郝邯生 毕 玲

鲍曼不动杆菌（Acinetobacter baumannii，Ab）是医院内感染最常见的病原菌之一，其对β内酰胺类、喹诺酮类以及氨基糖苷类抗菌药物的耐药性不断增加，出现了多重耐药以及泛耐药菌株，甚至是“超级细菌”。氨基糖苷类抗生素广泛用于革兰阴性杆菌感染，其耐药机制以往多集中在氨基糖苷类修饰酶的研究。近年来国内外先后发现了氨基糖苷类耐药的新机制16SrRNA甲基化酶基因（armA、rmtA、rmtB、rmtC、rmtD、rmtE、npmA）[1]。本研究旨在了解天津地区鲍曼不动杆菌16SrRNA甲基化酶基因携带情况，以及相关菌株的耐药情况，为临床抗菌药物治疗的合理选择和合理应用提供依据。

Table 1 Primers for PCR表1PCR引物序列

1 材料与方法

1.1 菌株来源及临床资料 收集天津地区2所三级甲等医院2010年8月—12月患者临床分离的鲍曼不动杆菌152株。包括来源于呼吸道（痰、肺泡灌洗液等）129例、伤口分泌物7例、血液4例、脑脊液3例、尿液1例、其他8例。男106例，女46例，患者年龄1 d~96岁，其中1 d~4岁的新生儿及婴幼儿分离的菌株（19株）多为敏感株。科室来源：重症监护病房（ICU）49例、神经科31例、新生儿科17例、其他内科33例、其他外科22例。

1.2 抗菌药物药敏纸片 所用纸片均购自天津市金章玉立科技发展有限公司。引物由北京六合华大基因技术有限公司合成。

1.3 培养基 水解酪蛋白琼脂（MH）购自上海伊华生物科技有限公司。

1.4 质控菌株 大肠埃希菌ATCC25022、铜绿假单胞菌ATCC27853为天津医科大学第二医院天津市感染性疾病研究所保存。鲍曼不动杆菌W61为经过测序证实携带armA基因，肺炎克雷伯菌390为经过测序证实携带rmtB基因，分别作为相应基因的阳性对照。

1.5 试剂 Premix Taq DNA聚合酶、DNA Marker购自宝生物工程（大连）有限公司。

1.6 方法

1.6.1 细菌鉴定及抗菌药物敏感试验 细菌鉴定和药敏试验采用全自动分析仪检测，部分头孢哌酮/舒巴坦和多黏菌素B的药敏检测采用纸片扩散法（Kirby-Bauer），耐药、中介、敏感的判读依据美国CLSI中非发酵菌的判定标准，头孢哌酮/舒巴坦参考头孢哌酮的标准。多重耐药是指对5类（包括抗假单胞菌的头孢菌素类、抗假单胞菌的碳青霉烯类、β内酰胺酶抑制剂复合制剂、抗假单胞菌的喹诺酮类、氨基糖苷类）中的3类或者3类以上的抗菌药物耐药［2］。泛耐药是指对上述5类均耐药，但对多黏菌素和替卡西林敏感［3］。

1.6.2 细菌模板制备及基因检测 采用煮沸法[4]制备DNA模板，-20℃保存。设计引物见表1。分别扩增armA、rmtA、rm⁃tB、rmtC、rmtD、rmtE、npmA基因。反应体系为25 μL，PCR产物经1%的琼脂糖凝胶电泳，0.5 mg/L EB染色，凝胶系统下观察结果。

1.6.4 PCR产物测序 由北京六合华大基因技术有限公司完成，结果经BLAST程序和Genebank数据库公布的标准菌序列进行比对。

1.7 统计学处理 采用SPSS 13.0统计软件进行分析，计数资料采用例（%）表示，采用χ2检验进行分析，以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 菌株对14种抗菌药物的药敏结果 152株鲍曼不动杆菌耐药现象严重，对多黏菌素B（0）的耐药率最低，其次为头孢哌酮/舒巴坦（15.79%）和左氧氟沙星（36.84%），对其他11种抗菌药物耐药率均在45%以上。90株为多重耐药菌株（59.21%），60株为泛耐药菌株（39.47%），见表2。

Table 2 Antimicrobial susceptibility results of 152 strains Acinetobacter baumannii to 14 antimicrobial agents表2 152株鲍曼不动杆菌对14种抗菌药物的药敏结果株（%）

2.2 16SrRNA甲基化酶基因的检测 实验菌株中共有83株同时对庆大霉素和阿米卡星耐药，armA基因阳性株73株，见图1，占耐氨基糖苷类菌株的87.95%（73/83），占实验菌株的48.03%（73/152），未检测出其他6种16SrRNA甲基化酶基因（rmtA、rm⁃tB、rmtC、rmtD、rmtE、npmA）。基因测序结果与Gen⁃Bank armA序列比对，同源性符合率为98%~99%。

Figure 1 Amplification of armA gene by PCR图1 PCR扩增armA基因结果

2.3 armA阳性菌株与阴性菌株的耐药率比较 73株armA基因阳性菌株耐药严重，对庆大霉素、阿米卡星、环丙沙星和哌拉西林的耐药率均为100%，对除多黏菌素B外的其余13种抗菌药物的耐药率明显高于armA阴性的菌株，差异有统计学意义（均P<0.01），见表3。73株armA阳性菌株多重耐药率为100%（73/73），泛耐药率为69.86%（51/73），79株armA阴性菌株中多重耐药率21.52%（17/79），泛耐药率11.39%（9/79）。

Table 3 Comparison of drug resistance rate between armA gene positive strains and armA gene negative strains表3 armA基因阳性菌株和armA阴性菌株耐药率比较株（%）

3 讨论

氨基糖苷类抗菌药物是临床上治疗革兰阴性菌感染的重要药物。该类药物通过与原核生物30S核糖体亚基16SrRNA上A位点的一个高度保守基元结合，从而引起核糖体功能改变，使细菌蛋白在合成时错误转录并抑制移位，导致细菌死亡。以往认为氨基糖苷类耐药的主要机制为产生了氨基糖苷类修饰酶。2003年Galimand等［6］首次从泌尿系统分离的耐多药肺炎克雷伯菌中发现了16SrRNA甲基化酶基因armA，研究表明该基因介导氨基糖苷类高水平耐药。迄今为止发现的16SrRNA甲基化酶基因有 7种（armA、rmtA、rmtB、rmtC、rmtD、rmtE、npmA），在鲍曼不动杆菌中仅检测到armA。16SrRNA甲基化酶使细菌30S核糖体亚单位中16SrRNA的A位点某个或某几个碱基甲基化，使氨基糖苷类抗菌药物不能与其作用靶点结合，从而导致细菌耐药。其中armA使A位点G1405上的N-7甲基化，破坏了G1405上N7与4，6二取代脱氧链霉胺的3′氨基形成氢键，在空间上阻碍G1405和庆大霉素的结合。同时，甲基化给G1405引入正电荷，不利于该类药物结合到解码位点，从而介导对氨基糖苷类耐药。

本研究首次对天津地区2所医院鲍曼不动杆菌临床株中16SrRNA甲基化酶基因的携带情况进行研究。结果显示，天津地区鲍曼不动杆菌对临床常用抗菌药物耐药严重，对多黏菌素B（0）的耐药率最低，其次为头孢哌酮/舒巴坦（15.79%）和左氧氟沙星（36.84%），对其他常用抗菌药物的耐药率在45%以上。本研究中对头孢哌酮/舒巴坦的敏感率为50%，对亚胺培南或美洛培南的敏感率为40.13%，这与中国CHINET鲍曼不动杆菌耐药监测网报道对头孢哌酮/舒巴坦敏感率为72.1%，对亚胺培南和美洛培南的敏感率为60.6%和55.5%相比[7]，敏感率低。

ArmA基因在韩国、北美、中国等多个国家和地区的鲍曼不动杆菌中均有检出[8]。近年来国内湖南[9]、上海[10]等多个地区也有报道，国内鲍曼不动杆菌中armA的检出率约为27%~60%，耐氨基糖苷类鲍曼不动杆菌中armA的检出率为37%~100%。本研究显示天津地区armA甲基化酶基因在鲍曼不动杆菌中的检出率为48.03%，在氨基糖苷类耐药菌株中的检出率为87.95%，未检测到rmtA、rmtB、rmtC、rmtD、rmtE、npmA。

对armA基因阳性和阴性菌株进行耐药率比较时发现，armA阳性菌株除多黏菌素B外，对其余13种抗菌药物的耐药率均明显高于armA阴性菌株，并且armA阳性菌株多重耐药率和泛耐药率远高于阴性菌株，这可能与armA基因通常由质粒携带，而质粒等移动元件通常同时携带更多的耐药基因有关，相应的机制仍需进一步研究。本研究中armA基因阳性菌株均为多重耐药菌株，但其在临床治疗上是否应按照多重耐药菌株选择抗菌药物仍需扩大样本量进一步研究。

近年来鲍曼不动杆菌临床分离率和多重耐药率逐年增高，16SrRNA甲基化酶基因armA在鲍曼不动杆菌中广泛存在，引起临床医师的高度关注；探讨其耐药特点对临床治疗中合理选择抗菌药物有指导意义；进一步研究16SrRNA甲基化酶基因armA阳性菌株的多重耐药对探讨不动杆菌的耐药机制有深层意义。

[1]Yang J,Ye L,Wang W,et al.Diverse prevalence of 16SrRNA methyl⁃ase genes armA and rmtB amongst clinical multidrug-resistant Escherichia coli and Klebsiella pneumoniae isolates[J].Int J Antimi⁃crob Agents,2011,38(4):348-351.

[2]Peleg AY,Seifert H,Paterson DL.Acinetobacter baumannii:emergency of a successful pathogen[J].Clin Microbiol Rev,2008,21(3):538-582.

[3]Munoz-Price LS,Weinstein RA.Acinetobacter infection[J].N Engl J Med,2008,358(12):1271-1281.

[4]Pitout JD,Thomson KS,Hanson ND,et al.Plasmid-mediated resistance to expanded-spectrum cephalosporins among Entetobacter aerogenes strains[J].Antimicrob Agents Chemother,1998,42(3):596-600.

[5]Davis MA,Baker KN,Orfe LH,et al.Discovery of a gene conferring multiple-aminoglycoside resistance in Escherichia coli[J].Antimi⁃crob Agents Chemother,2010,54(6):2666-2669.

[6]Galimand M,Courvalin P,Lambert T.Plasmid-mediated high-level resistance to aminoglycosides in Enterobacteriaceae due to 16SrRNA methylation[J].Antimicrob Agents Chemother,2003,47(8):2565-2571.

[7]史俊艳,张小江,徐英春,等.2007年中国CHINET鲍曼不动杆菌耐药性监测[J].中国感染与化疗杂志,2009,9(3):196-200.

[8]Cho YJ,Moon DC,Jin JS,et al.Genetic basis of resistance to amino⁃glucosides in Acinetobacter spp.and spread of armA in Acineto⁃bacter baumannii sequence group 1 in Korean hospital[J].Diagn Mi⁃crobiol Infect Dis,2009,64(2):185-190.

[9]王敏,申菲,李先平，等.鲍曼不动杆菌armA基因的分布与耐药性的研究[J].中华微生物和免疫学杂志,2009,29(11):1004-1008.

[10]奚俊,应春妹.耐氨基糖苷类抗生素鲍曼不动杆菌中armA和rmtB甲基化酶基因的检测[J].中国感染与化疗杂志,2010,10(3):209-212.