Skp2和p27kip1在乳腺癌组织中的表达及其相关性的研究

冯爱强 李蕾蕾 张彦武 胡花丽 王 举

细胞周期抑制蛋白（p27kip1）和S期激酶相关蛋白酶2（Skp2）是近年来发现的2个重要信号传导分子，参与调控细胞增殖和凋亡，与肿瘤发生发展密切相关[1]。但其在乳腺癌发生发展中的研究少见报道。本研究对40例乳腺癌组织中Skp2、p27kip1 mRNA进行检测，并分析其与临床病理因素的关系，报告如下。

1 对象与方法

1.1 研究对象 选择2009年10月—2011年5月于本科治疗的乳腺癌患者40例，年龄23~67岁，平均年龄（50.18±12.65）岁。病理类型均为浸润性导管癌，病理分期及组织学分级按WHO分期及分级标准，另取乳腺纤维腺瘤标本20例，以同期正常乳腺组织标本（取癌灶边缘5 cm以上经病理学检查的正常乳腺组织）20例作为对照。所有组织标本均经病理学证实，而且术前均未接受放疗、化疗及内分泌等治疗。

1.2 方法

1.2.1 标本收集与处理 将新鲜组织标本1.5 g置于1.5 mL DEPC处理过的EP管中，立即置于-80℃冰箱备用。

1.2.2 半定量逆转录聚合酶链反应（RT-PCR） 乳腺癌组织、乳腺纤维腺瘤组织、正常乳腺组织均按Trizol一步法提取组织中的总RNA，用紫外分光光度计测定RNA样品的OD260/OD280值，观察提取RNA样品的纯度并计算其含量。参照文献[2]设计PCR引物，Skp2引物序列：上游5′-ATGTGACTGGTCG GTTGC-3′，下游5′-TCGATAGGTCCATGTGCT-3′，扩增产物片段长度120 bp；p27kip1引物序列：上游5′-AGCTTGCCC GAGTTCTACTA-3′，下游5′-GCTTCTTGGGCGTCTGCT-3′，扩增产物片段长度325 bp。以葡萄糖醛酸脱氢酶（GAPDH）为内参照，引物序列：上游5′-AACGGATTTGGTCGTATTG-3′，下游5′-CACAGTCTTCTGGTGGC-3′，扩增产物片段长度为540 bp。RT参照试剂盒（Takara公司）说明书操作，反应体系为10 mL，RNA模板量为1 μL，反应条件：30℃水浴10 min，42℃水浴30 min，99℃水浴5 min，5℃水浴5 min。PCR反应条件为94℃预变性2 min，94℃变性30 s，64℃复性30 s，72℃延伸1 min，35个循环，72℃延伸10 min。-80℃冰箱保存备用。将5 μL PCR产物于2%琼脂糖凝胶（0.5 mg/L）溴化乙锭染色上电泳，紫外灯下观察成像。

1.2.3 表达结果判断标准 PCR产物半定量分析用天能GIS凝胶图像分析系统扫描凝胶，进行吸光度扫描和测定灰度，以GAPDH作为内参照校正，用目的基因与GAPDH灰度比值表示目的基因的相对表达含量。

1.3 统计学处理 应用SPSS 17.0软件进行统计学分析。计量资料用方差分析，组间比较采用LSD-t检验。与病理学参数关系采用Pearson相关或Spearman相关，P<0.05为差异有统计学意义。

Figure 1 RT-PCR test results图1 RT-PCR检测结果

Table 1 Expressions of Skp2 mRNA and p27kip1 mRNA in breast carcinoma,breast fibroadenoma and normal tissues表1Skp2 mRNA与p27kip1 mRNA在乳腺癌组织、乳腺纤维腺瘤和正常组织中的表达 ±s）

Table 1 Expressions of Skp2 mRNA and p27kip1 mRNA in breast carcinoma,breast fibroadenoma and normal tissues表1Skp2 mRNA与p27kip1 mRNA在乳腺癌组织、乳腺纤维腺瘤和正常组织中的表达 ±s）

*P<0.05，**P<0.01；表2同

组别正常乳腺组织（1）乳腺纤维腺瘤（2）乳腺癌（3）F P（1）∶（2）（1）∶（3）（2）∶（3）n 20 20 40 Skp2 0.114±0.002 0.267±0.073 0.529±0.325 22.000**0.132<0.001 0.004 p27kip1 0.779±0.145 0.673±0.124 0.519±0.251 111.820*0.201 0.001 0.020

2 结果

2.1 不同组织中Skp2、p27kip1 mRNA的表达 在乳腺组织中均可检测到2种基因的表达。乳腺癌组织中Skp2 mRNA表达水平明显高于乳腺纤维腺瘤和正常乳腺组织（P<0.05），而其在正常乳腺组织与乳腺纤维腺瘤的表达差异无统计学意义（P>0.05）；乳腺癌组织中p27kip1 mRNA的表达水平明显低于乳腺纤维腺瘤组织和正常乳腺组织（P<0.05），而在正常乳腺组织与乳腺纤维腺瘤比较差异无统计学意义（P>0.05），见图1、表1。

2.2 乳腺癌组织中Skp2、p27kip1 mRNA表达与不同临床病理因素的关系 Skp2 mRNA的表达与乳腺癌的淋巴结转移情况及组织学分级呈正相关；p27kip1 mRNA的表达与乳腺癌的淋巴结转移情况及组织学分级呈负相关；Skp2 mRNA、p27kip1 mRNA表达与患者年龄、绝经状况、肿瘤大小和病理学分期均无明显相关性（P>0.05），见表2。

2.3 Skp2、p27kip1 mRNA表达的相关性 乳腺癌组织中Skp2 mRNA、p27kip1 mRNA相对表达水平呈负相关（r=-0.497，P<0.001）。

3 讨论

P27kip1是细胞周期蛋白依赖性激酶抑制物（CKI）家族的一员，可阻止细胞通过G1/S期而抑制细胞增殖[2]。Skp2是近来发现的Skp1-Cullin-F-box（SCF）E3酶复合体中的一种F-box蛋白，其包含的亮氨酸结构域可与磷酸化的p27kip1结合，从而使后者进入泛素蛋白酶水解途径降解[3]。

本研究结果表明，乳腺癌组织中Skp2基因显著高于正常乳腺组织，p27kip1 mRNA表达显著低于正常乳腺组织，提示Skp2基因激活，p27kip1基因失活可能是乳腺癌发生发展过程中的重要诱导因素,可能的机制是p27kip1基因表达降低时对G1/S调控点的抑制作用减弱，细胞加速进入S期，导致细胞增殖加快。而Skp2基因表达增加时加强了泛素蛋白酶水解途径对p27kip1的降解，同样导致p27kip1含量减少，对G1/S调控点的抑制作用减弱，细胞加速增殖。当细胞增殖失控时，乳腺癌的发生、发展就不可避免。

Skp2在许多人类恶性实体肿瘤中呈高表达[4]。Skp2在食管癌组织中呈高表达[5]。有文献报道Skp2与p27kip1蛋白表达在人类许多恶性实体肿瘤中呈负相关[6]。Erkanli等[7]研究发现p27蛋白在子宫内膜癌组织中表达较正常增殖期内膜癌明显降低，与病理分级、肌层浸润深度等呈明显的负相关，而p27kip1 mRNA在子宫内膜癌中与病理分级、肌层浸润深度等无明显相关性[8]。

本研究发现，Skp2 mRNA的表达与乳腺癌的淋巴结转移、组织学分级呈显著正相关，p27kip1 mRNA的表达与乳腺癌的淋巴结转移、组织学分级呈显著负相关，提示Skp2基因过度表达，p27kip1基因低表达，对判断乳腺癌的恶性程度具有一定的促进作用。由此可推测，乳腺癌组织中Skp2基因表达水平越高，p27kip1基因表达水平越低时，可能导致其肿瘤分化程度越低，恶性程度越高，其淋巴结转移的可能性越大，其侵袭能力和恶性程度就相对越高，缓解期越短。而肿瘤组织学分级、淋巴结转移均为预后不良的因素，可结合其他预后不良指标及高危因素综合判断预后及指导临床治疗。手术-病理分期指标也标志着肿瘤的侵袭与进展，但本研究未发现Skp2 mRNA和p27kip1 mRNA的表达与其有明显的相关性，原因可能是乳腺癌期别较晚者，往往更多地选择新辅助治疗，而临床无法获得新辅助前的手术标本，使收集例数减少。因此，乳腺癌组织中Skp2基因表达上调，p27kip1基因表达下调，可能参与了乳腺癌的发生和发展过程，为乳腺癌的早期基因诊断及基因靶向治疗提供了参考。

Table 2 Correlation of Skp2 mRNA and p27kip1 mRNA expression in breast cancer tissues and clinical pathological factors表2 乳腺癌组织中Skp2 mRNA和p27kip1 mRNA的表达与临床病理因素的关系

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