特异siRNA下调卵巢癌H08910细胞NAC-1基因表达并抑制生长

桂 玲，王 静，祝爱珍，刘成成，刘革修

(1.湖南省肿瘤医院妇瘤科，湖南长沙410006;2.暨南大学医学院血液病研究所，广东广州 510632)

最近研究发现，卵巢癌中存在卵巢癌干细胞(cancer stem cells，CSCs)［1］，且与卵巢癌发生发展及其多药耐药密切相关［2］。这些研究结果提示，卵巢癌干细胞是卵巢癌防治过程中重要靶细胞。

NAC-1(nucleus accumbens-1)蛋白属于BTB/POZ转录因子家族成员，通过BTB/POZ结构域形成二聚体，与一些核蛋白相互作用，调节细胞生物学活性，参与胚胎干细胞的自我更新和多能性分化。在浆液性卵巢癌组织和细胞系中NAC-1表达和紫杉醇体外耐药相关，NAC-1通过部分抑制Gadd45gip1的表达、负向调节 Gadd45肿瘤抑制途径的组成，包括Gadd45α及其结合蛋白Gadd45gip1，从而促进肿瘤的生长和存活［3］。所以，本研究探究增强卵巢癌治疗效果的辅助方法，为提高临床卵巢癌治疗效果提供实验依据。

1 材料与方法

1.1 材料和试剂:人卵巢癌细胞系HO8910(中国科学院上海细胞生物研究所，由暨南大学生命科学技术学院生殖研究室保存);RPMI-1640培养液(Gibco公司);新生胎牛血清(杭州四季青生物工程科技有限公司);MTT(Sigma公司);脂质体转染试剂盒LipofectamineTM2000(Invitrogen公司);Trizol、反转录试剂盒和SYBR GreenⅠMix试剂盒(Tiangen公司)、MTT试剂盒、蛋白裂解液和电化学发光(electrochemilum-inescence，ECL)试剂盒(碧云天生物技术有限公司);特异性siRNA和阴性对照siRNA(广州市锐博生物科技有限公司)。

1.2 靶向NAC-1基因寡核苷酸的设计:根据NAC-1基因的序列号NM 052876.21设计2条特异性siRNA序列:NAC-1 siRNA-1 为5'-UGACAGGCACCAACGUGUACA-3'，NAC-1 siRNA-2为5'-GAACUCGGUGCCCUUCUCCAU-3';另外设计一条阴性对照，与已知的人类基因无同源性，序列为5'-GACTT CATAAGGCGCATGC-3'。

1.3 细胞培养和转染:将人卵巢癌细胞系HO8910细胞以1×106个/孔接种于6孔板，用含10%胎牛血清的 RPMI 1640培养液培养于CO2体积分数为5%的37℃培养箱中。当细胞生长至约70%汇合度时，参考试剂盒说明书，用脂质体分别转染各种siRNA(50 nmol/L)。实验分组:空白对照(control)组、阴性siRNA(negative siRNA)组和NAC-1 siRNAs(包括 NAC-1-siRNA-1、2)组。

1.4 MTT法检测细胞增殖活性:收集转染48 h后的细胞，将细胞重悬，以5×103个/孔接种于96孔板，每孔100 μL，并设置3个复孔。继续培养细胞0、24、48、72和96 h后，每孔加入MTT液20 μL，继续培养4 h后，低速离心10 min弃上清液，每孔加入150 μL DMSO，振荡使沉淀充分溶解，在酶标仪490 nm波长处检测吸光度(A)值，计算细胞增殖抑制率:细胞增殖抑制率 =(1－转染组 A490nm/空白对照组 A490nm)×100%。

1.5 克隆形成实验检测细胞生长情况:转染48h后，收集细胞、重悬，以3×102个/孔接种于6孔板继续培养，每隔3 d换1次培养液。10 d后终止细胞培养，PBS清洗3次，多聚甲醛溶液固定，0.1%结晶紫染色10 min后，显微镜下计数含大于10个细胞的细胞克隆数，计算克隆形成率。克隆形成率=克隆数/接种细胞数×100%。

1.6 FCM法检测细胞周期:用0.25%胰蛋白酶收集转染48 h后的细胞，用PBS洗涤细胞后，加入1 mL70%乙醇4℃固定过夜，PBS洗涤细胞1次，重悬细胞于500 μL PBS，加入碘化丙啶(propidiumiodide，PI)染色液(含RNA酶)，终浓度50 mg/L，避光染色30 min，300目尼龙网过滤后使用流式细胞仪计数各细胞周期的细胞数。

1.7 实时荧光定量RT-PCR法检测NAC-1 mRNA表达:siRNA转染48 h后收集细胞，提取总RNA、并用紫外分光光度计定量，取1 μg反转录合成cDNA。以cDNA为模板、NAC-1基因特异性引物进行实时荧光定量PCR分析，根据2－△△Ct方法分析目的基因的mRNA相对表达水平。NAC-1基因上游序列为 5'-CCAGACACTGCAGATGGAGA-3'，下游序列为5'-AAGCTGAGGATCTGCTGGAA-3'，扩增片段为227 bp;内参GAPDH上游序列为5'-GAGTCAACGGATTTGGTCGT-3'，下游序列为5'-TTGATTTTGGAGGGATCTCG-3'，扩增片段为219 bp。

1.8 Western印迹法检测NAC-1蛋白表达:siRNA转染48 h后收集细胞，提取细胞总蛋白，采用BCA法进行蛋白定量。取等量蛋白30 μg上样，进行12%的SDS-PAGE，120 V恒压电泳1 h，200 mA恒流转膜1 h，含5%脱脂奶粉的TBST对膜封闭30 min，加入鼠抗人NAC-1(1∶200)或兔抗人GAPDH抗体于4 ℃孵育过夜((Sigma，Cat#G9545，1∶4 000)，次日加入辣根过氧化物酶(horseradish peroxidase，HRP)标记的相应二抗IgG(稀释比例为1∶3 000)于室温孵育1 h，TBST 洗膜10 min×3次。最后，ECL发光显色，X色胶片曝光，采集图像，采用 Gelpro4.0软件对目的蛋白进行定量分析。以GAPDH作为内参对照。

2 结果

2.1 siRNA转染对卵巢癌HO8910细胞NAC-1基因表达水平的影响:转染 NAC-1特异 siRNA的2组都能显著沉默NAC-1基因的表达(P＜0.05)，其中，转染NAC-1-siRNA-1后，NAC-1mRNA和蛋白表达水平最低(图1A，B)。因此，后续实验选择NAC-1-siRNA-1进行基因转染。

2.2 NAC-1 siRNA转染对卵巢癌HO8910细胞细胞增殖的影响:转染48、72和96 h后，NAC-1-siRNA-1组 HO8910细胞增殖开始受到明显抑制，增殖抑制率分别为(28.60±6.33)%、(39.95±7.83)%和(42.87±9.29)%(P＜0.05);而转染阴性siRNA对HO8910细胞增殖无明显影响。克隆形成实验结果与MTT检测结果具有一致性，转染NAC-1-siRNA-1后HO8910细胞的克隆集落数为(38.67±4.83)，显著低于空白对照组和阴性对照组克隆集落数(89.81±5.47)和(90.24±5.65)(P＜0.05)。

2.3 NAC-1 siRNA转染对卵巢癌HO8910细胞细胞周期分布的影响:空白对照组与阴性siRNA组中卵巢癌HO8910细胞细胞的细胞周期分布无差异，而转染NAC-1-siRNA-1后G1期HO8910细胞比例显著增高(P＜0.05，图2，表1)。

表1 NAC-1 siRNA转染对卵巢癌HO8910细胞细胞周期分布的影响Table 1 Effect of NAC-1 siRNA transfection on cell cycle distribution of ovarian cancer HO8910 cells(±s，%，n=3)

表1 NAC-1 siRNA转染对卵巢癌HO8910细胞细胞周期分布的影响Table 1 Effect of NAC-1 siRNA transfection on cell cycle distribution of ovarian cancer HO8910 cells(±s，%，n=3)

*P＜0.05 compared with the control group.

group G0/G1G2 S G2/M control 42.38±5.73 24.92±4.47 31.70±4.74 negative siRNA 45.68±5.95 22.45±4.60 31.87±4.66 NAC-1 siRNA-1 62.53±6.73* 12.99±3.10*24.48±3.84

3 讨论

研究发现，NAC-1与胚胎干细胞的多能分化有关，调节其他多能分化因子的表达，如 Nanog、Oct4、Sox2、Klf4、Sall1 和Sall4等，参与蛋白质间的相互作用和转录调控网络，参与胚胎干细胞的自我更新和多能性分化，对胚胎干细胞的多能分化是至关重要的。研究显示，NAC-1在多种恶性肿瘤中表达上调，包括:胰腺癌、大肠癌、乳腺癌、肾细胞癌、肝癌和宫颈癌。在卵巢癌中发现化疗后复发的患者体内NAC-1表达水平明显高于初发未治者，NAC-1表达和紫杉醇体外耐药相关［3］;NAC-1通过部分抑制 Gadd45gip1的表达、负向调节Gadd45肿瘤抑制途径的组成包括Gadd45α及其结合蛋白Gadd45gip1，从而促进肿瘤的生长和存活［3］。这些资料表明，NAC-1是高度恶性的卵巢癌复发相关基因。所以，通过抑制其表达、抑制卵巢癌细胞生长活性，反转药物耐药性是一个诱人的目标。

本研究通过脂质体转染方法将NAC-1 siRNA-1、siRNA-2分别导入卵巢癌细胞后，发现目的基因NAC-1 mRNA及其蛋白表达下调、细胞的生长活性明显受到抑制，且细胞周期被阻滞于G1期，其中NAC-1 siRNA-1比siRNA-2的作用更为明显。本研究表明，NAC-1在肿瘤细胞的生长和存活中起着非常重要的作用。推测NAC-1基因可能成为治疗卵巢癌的一个新靶点。后续研究将深入探讨利用NAC-1 siRNA-1提高卵巢癌细胞对化疗药物的敏感性问题。

［1］Hu L，McArthur C，Jaffe RB.Ovarian cancer stem-like side-population cells are tumourigenic and chemoresistant［J］.Br J Cancer，2010，102:1276 －1283.

［2］Kobayashi Y，Seino K，Hosonuma S，et al.Side population is increased in paclitaxel-resistant ovarian cancer cell lines regardless of resistance to cisplatin［J］.Gynecol Oncol，2011，121:390－394.

［3］Ishibashi M，Nakayama K，Yeasmin S，et al.A BTB/POZ gene，NAC-1，a tumor recurrence-associated gene，as a potential target for Taxol resistance in ovarian cancer［J］.Clin Cancer Res，2008，14:3149－3155.