怀地黄不同种质杂交育种初步研究

李建军，徐玉隔，王 莹，卢新花，李静云，范红军，杨 丽

(1．河南师范大学生命科学学院，河南新乡453007;2．河南省高校道地中药材保育及利用工程技术研究中心;河南新乡453007;3．封丘县农村科技研究开发推广中心，河南封丘453341)

地黄是玄参科植物地黄(Rehmannia glutinosa Libosch)的新鲜或干燥块根．地黄为补益中药中常用药物，始载于《神农本草经》，列为上品［1］．地黄主要产于河南、河北、山东、山西等地，其中河南产量大、质量佳，为传统的道地药材．以旧称“怀庆府”的河南温县、武陟、沁阳、孟州等地为地黄的道地药材产区，怀庆主产的地黄习称为“怀地黄”［2］．怀地黄因长期的自然选择与人工筛选，种质表现出显著的遗传多样性，形成了很多农家品种．目前杂交试验所用主要农家品种有85－5、北京1号、生津、北京3号、沁怀、怀地1号、怀地2号、怀地3号等［3～6］．长期的无性繁殖，会出现根茎变细，产量下降，质量变差，最终丧失品种的优良特性．在种植过程中，为节约用种量，将细长根茎留种，大的根茎作商品，无形中实现了选劣汰优，导致种性退化［7］．本试验通过怀地黄农家品种间的杂交，创制出新的怀地黄新种质，并为选育杂交优良新品种奠定物质基础，对地黄种质资源的保护与可持续利用有重要的意义．

1 材料与方法

1．1 供试材料

供试材料为封丘资源圃中的8个怀地黄农家栽培品种(2011－07种植)和1个野生地黄品种，8个农家品种分别为85－5、北京1号、生津、北京3号、沁怀、怀地1 号、怀地2 号、怀地3 号［8～13］，见表1．

1．2 杂交组合

采用完全随机区组设计进行杂交试验，将各个品种分别作为母本和父本与不同品种进行杂交和自交授粉试验．野生地黄仅作为杂交父本，与其他品种杂交．因此共有72个杂交组合，每个杂交组合做10朵花，重复3次．

1．3 杂交方法

1．3．1 亲本的株选 8个地黄品种85－5，北京1号，生津，北3号，沁怀，怀地1号，怀地2号，怀地3号，分别编号为 1，2，3，4，5，6，7，8．选择具有代表品种性状的、生长健壮无病虫害的典型植株作为杂交的亲本．

1．3．2 花序选择及整枝疏花 一般自然生长的种株分枝较多，而作杂交亲本时，为便于操作并保证营养供应，使种子发育饱满，要适当整理植株，去除过多无效的高次分枝，用剪刀将株上的其他花去除，只留下将要杂交的花．

1．3．3 花粉采集 杂交前在生长健壮的父本植株上剪取发育良好即将开放的花蕾，放于玻璃瓶中．

1．3．4 去雄 选开花前1～2 d的花蕾，此时花比较长还没有开放，处于似开非开的状态．用镊子轻轻地将花瓣拨开，并插入花药基部，夹住花药向上一拨即可．注意把花药清除干净，撑开操作时不要损坏柱头，尽量减少破坏花冠，以使柱头仍处在一个适宜的环境之中．去雄时间一般应在6:00—8:00和16:00—18:00，因这时温度低，花器失水少，也有利于伤口的愈合．

1．3．5 授粉套袋 在去雄后即可授粉．用毛笔沾取父本的花粉涂在母本雌蕊的柱头上，授粉后，立即套上硫酸纸袋封好，进行隔离，并挂上标签注明杂交组合和授粉日期．授粉时特别要注意，每个组合授粉完毕后，必须用酒精棉球将镊子彻底消毒后，再做下一个组合．授粉的时间在8:00—10:00和16:00—18:00为佳．

1．3．6 授粉管理 杂交后的最初几天要检查纸袋，如脱落、破碎，有可能发生了以外的杂交，这些杂交花无效，应重新补做．生长期间搞好田间水肥管理，及时锄草，确保杂交种的正常成熟．授粉7～10 d后，当花瓣萎谢，柱头因受精而干枯变黑色，即可去袋．去袋时可以统计杂交的结果数，初步统计结果率．

1．3．7 蒴果采收 授粉后1个月左右蒴果成熟开裂，以组合为单位，按区号和相应的组合名称将杂交成熟蒴果单收单晒，妥善保存，以备播种，并统计获得杂交蒴果的数量，计算每个杂交组合结果率．

1．4 结籽统计

地黄果实成熟开裂后采回试验室．统计每个朔果所含发育成熟的种子个数，并用1/10 000电子天平称量其总重，并计算出种子的千粒重．

2 结果与分析

2．1 结实统计分析

地黄授粉后其子房出现3种情况:①子房随花瓣的凋谢而萎蔫;②花瓣凋谢而子房逐渐膨大，但不能正常发育成蒴果而中途凋谢;③花瓣凋谢而子房逐渐膨大，发育成成熟的蒴果．结果率是按第3种情况统计的，72个杂交组合结果率见表2．

表2 地黄不同种质杂交结果率Table 2 The hybrid ftuit rate of different Rehmannia glutinosa germplasms %

由表2可知，试验共进行了72个杂交组合，最终61个杂交组合获得种子．地黄品种间杂交结实率在30% ～100%，其中，生津×怀地1号杂交结实率最低为30%;其次，北京1号×生津、北京1号×怀地2号、生津×北京1号、生津×怀地2号和沁怀×怀地2号杂交结实率为50%;其三，生津×怀地3号、北京3号×沁怀、怀地1号×怀地2号、怀地1号×怀地3号、怀地2号×生津、怀地3号×沁怀、怀地3号×怀地1号和怀地3号×怀地2号杂交组合结实率最高为100%;野生地黄作为父本与8个地黄农家品种杂交结实率比较高，在70% ～100%之间;各个品种自交结实率为0，说明遗传基础一致性不亲和;特殊情况是85－5×怀地3号正反交结实率均为0，原因是怀地3号是从85－5中选育出来的优势株，遗传基础一致，可以认为是同一品种;说明怀地黄品种间杂交，亲缘关系越远，杂交结实率越高，怀地黄品种内杂交不亲和，详细机理有待进一步研究．

2．2 结籽情况统计分析

成熟蒴果内有2类种子:一类褐色种子是发育成熟的，可直接播种繁殖．另一类白色扁小种子是发育不成熟的，不能正常发育繁殖，在净种过程中去除这类种子．本实验只统计发育成熟的种子．根据杂交组合结果数量和结籽数量，统计单果平均籽粒数并计算千粒重，结果见表3．

由表3可知，单蒴果平均结籽数因亲本不同差别较大，为58～384粒，最少是沁怀×85－5为58粒，最多是北京3号×野生地黄为384粒．种子的千粒重差别也较大，为0．081 2 ～0．140 8 g，最低是北京1号×生津千粒重为0．081 2 g，说明种子小而不饱满，最高是怀地2号×野生地黄千粒重达0．140 8 g，说明种子大而饱满．在所有杂交组合中，与野生品种杂交地黄单蒴果平均结籽数和千粒重普遍偏高，说明杂种优势明显．后代生物产量、块根产量和质量是否明显，有待进一步研究．

表3 各品种正反交结籽情况统计Table 3 The statistics of reciprocal cross to win the seed of various varieties

续表 Continuing table

正交和反交的单蒴果结籽数大部分属于正相关关系，正交单蒴果结籽数多，反交单蒴果结籽数也多，少数组合差别较大．如沁怀×怀地2号反交结籽较多、北京3号×怀地3号正交结籽较多、怀地2号×北京3号反交结籽较多、85－5×生津正交结籽较多、沁怀×怀地1号正交结籽较多，说明这些正反交组合中有的做母本结籽较多，有的做父本结籽较多．正交和反交的千粒重大部分属于正相关关系，正交千粒重高，反交千粒重也高，少部分组合差别较大．如85－5×生津、85－5×北京1号和北京1号×沁怀正交千粒重偏高;生津×怀地2号、北京1号×怀地3号和北京1号×生津反交千粒重偏高．

在所有杂交组合中，正交和反交的单果平均结籽数为113～384粒，正交和反交的平均结果率为45%～100%;正交和反交的单果平均结籽数与平均结果率大部分属于正相关关系，单果平均结籽数越多，其平均结果率越高;少部分属于负相关关系．如北京1号×沁怀、85－5×沁怀杂交单果平均结籽数最低，但其平均结果率分别为90%和80%;生津×怀地1号杂交平均结果率最低，其单果平均结籽数192粒．

3 结论与讨论

72个杂交组合结实率的差异，说明怀地黄品种间杂交，亲缘关系越远，杂交结实率越高;怀地黄品种内杂交不亲和．自交不亲和性［14－16］实质上是自花授粉时受精过程受阻，不同物种受阻的时期有所不同．原因是玄参科的植物表现了配子体自交不亲和，花粉管停止生长，发生细胞程序性死亡［17］．配子体自交不亲和中，雄配子本身的基因不能与雌蕊孢子体基因中的任何一个相同，如果相同，则花粉管不能生长［17］．只有与雌蕊孢子体基因都不同的花粉才能完成受精过程．详细分子机理有待进一步研究．

在杂交繁育的过程中，利用自交不亲和系生产杂种是一种非常简便的制种方法．利用地黄自交不亲和的特性，通过杂交可以鉴别新品种是否与现有品种相同．为保持地黄农家品种资源只有通过无性繁殖，一旦消失很难恢复，故要加强地黄资源的保护和可持续开发利用．本试验表明，在所有杂交组合中，正交组合间、反交组合间都存在显著差异，农家品种间杂交亲缘关系越远，单果结籽数和千粒重越高;农家品种与野生地黄杂交单蒴果平均结籽数和千粒重普遍偏高;正交与反交单果结籽数和千粒重没有规律，有些品种适宜做母本，而有些品种适宜做父本，为有性繁殖和杂交育种选择亲本提供理论依据．后代发芽势、发芽率、抗性、产量、品质等指标有待下一步研究．

［1］ 刘钦松，张留记，屠万倩，等．地黄研究进展［J］．河南中医，2009(5):15－17．

［2］ 温学森，杨世林，魏建和，等．地黄栽培历史及其品种考证［J］．中草药，2002，33(10):946 －949．

［3］ 董诚明，李增光，李汉伟，等．河南地黄栽培品种调查与品质评价研究［C］．第10届全国中药和天然药物学术研讨会．洛阳，2009．

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［5］ 李建军，王 莹，朱明炜，等．怀地黄不同主栽品种花粉形态比较［J］．河南农业大学学报，2012，46(2):127－130

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［7］ 中国医学科学院药用植物资源开发研究所．中国药用植物栽培学［M］．北京:农业出版社，1991．

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